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TA克隆，連接轉化能長菌落，但是菌液PCR鑒定沒有結果 已有4人參與
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PCR擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒回收純化PCR產物，電泳檢測條帶單一，濃度為50ng/微升。 PCR產物和pMD 18-T 載體連接，連接體系是：PCR產物3.5微升，pMD 18-T vector 1微升，水0.5微升，Solution I 5微升。16℃連接3h，使用的是PCR儀器。 固體LB培養(yǎng)基配制：胰蛋白胨1g，酵母浸粉0.5g，氯化鈉1g，加水定容100ml，調節(jié)PH為7.5，高溫高壓滅菌30min，待溫度適宜，加入IPTG 20微升，X-gal 100微升，AMP 100微升，倒板。 10微升連接產物全部轉入50微升大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，冰浴30min，42℃熱激90s，冰浴2min，加入700微升液體LB培養(yǎng)液，37℃恒溫搖床200rpm 1h，4000rpm離心5min，棄上清500微升，重懸浮，涂板，37℃過夜培養(yǎng)。我看有些人的實驗記錄都是12-14h就能挑菌了，但是我的12-15h內很難看清藍白斑，我一般是等到16-18h之間才能很明顯分辨出藍白斑菌落，這時候才能挑白斑，于1ml 含1微升AMP的液體LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫搖床復蘇8h。 菌液PCR鑒定，10微升體系是：Taq酶0.05微升，buffer 1微升，dNTP 0.8微升，上游引物0.5微升，下游引物0.5微升，菌液1微升0.5微升0.3微升都有做過，加水至10微升。引物使用的是之前PCR擴增引物。反應程序有所改變，95℃預變性時間從之前的5min變成15min。 挑單克隆菌落的時候，看著藍白斑菌落很明顯能分開，并且感覺長勢不錯，信心滿滿，但是菌液PCR怎么都沒有條帶，心都碎了。。。。crying 在半個月之前用同樣的方法，不同的基因克隆，還做的不錯，測序結果也挺好。 1、有人說插入片段和載體的比例，我算了一下，符合比例的范圍啊。 2、不是不長菌落，能區(qū)分藍白斑，只是時間久點，感覺長的還不錯。 3、菌液PCR做了梯度，還做了對照，酶等試劑沒有問題。 可是還找不到原因原因到底在哪啊。。。。老板不管你中間費了多少勁，沒有結果可不行啊。。。求小伙伴兒分析原因，相助  |
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【答案】應助回帖
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xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-14 09:44:32
xn8008: 應助指數+1 2016-10-14 09:44:49
lyzjc: 回帖置頂 2017-03-03 19:46:10
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lyzjc: 回帖置頂 2017-03-03 19:46:10
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謝謝各位回復。 經自己的不斷重復摸索，成功連接了一個，并且成功測序。今天做的菌液PCR鑒定也成功擴增出陽性克隆，已送去測序。 1、克隆相關的試劑一個都沒有更換。 2、懷疑連接時間不夠，把連接時間增加到6h左右。 3、懷疑與菌液濃度有關，把搖菌所加液體LB培養(yǎng)基增加到4ml和2ml，且都有擴增成功。 我認為一般克隆不成功的原因，再排除操作手法的原因之后，最大可能得原因有兩點： 1、連接不成功 2、菌液PCR環(huán)節(jié)出了問題，最有可能就是菌液濃度。 希望給自己，也給大家一個經驗參考。 |
15樓2016-10-13 19:46:39
781055707
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應助回帖
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xn8008: 應助指數+1 2016-10-14 09:43:15
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菌長出來了，應該不是轉化的問題，考慮是不是載體問題，會不會自連了，我們用19t，有時候假陽性特別多，p不出來，后來酶切發(fā)現全都自連的，后來換個批次就好了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2016-09-28 23:54:20
8樓2016-10-01 08:08:29
9樓2016-10-01 08:11:31
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