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梧桐柒夕主管區(qū)長(zhǎng) (文壇精英)
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質(zhì)粒PCR產(chǎn)物片段大小問(wèn)題 已有3人參與
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| 質(zhì)粒為pUC57的大腸桿菌，質(zhì)粒提取用的是自制試劑盒，經(jīng)電泳過(guò)后確定是pUC57，然后用的是50μl的Taq體系進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，引物自設(shè)的，將產(chǎn)物進(jìn)行電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)有兩種不同的情況。其一是得到了400+的片段（此片段為正常片段），但同時(shí)做的相關(guān)平行組還得到了6000左右的片段。有沒(méi)有相關(guān)PCR通透者可以解釋一下，這個(gè)6000左右的片段會(huì)產(chǎn)生的原因？以及這個(gè)6000的片段是否正常？ |
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hailunl
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-28 16:30:18
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有非特異性很正常，PCR不能說(shuō)明問(wèn)題。 例如，引物特異性不好，或者退火溫度過(guò)低，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶， 只要有目標(biāo)條帶就可以了。 如果你想再檢測(cè)，建議提高退火溫度，質(zhì)粒為模板，退火溫度高點(diǎn)沒(méi)事；延伸時(shí)間掌控在目標(biāo)條帶范圍；另外，模板稀釋10倍或50倍。 |
2樓2014-06-08 19:11:00
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3樓2014-06-08 19:35:27
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梧桐柒夕: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-06-09 07:28:36
梧桐柒夕: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-06-09 07:28:36
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很明確告訴你，不可能是所有產(chǎn)物連在一起。什么轉(zhuǎn)了一圈不一圈的，不要相信那些胡言亂語(yǔ)。我最討厭不懂裝懂。 你延伸時(shí)間多長(zhǎng)擴(kuò)出6K的片段？你延伸400左右的片段擴(kuò)出這么長(zhǎng)的，不可能轉(zhuǎn)了一圈。 如果你真想找出原因，回收，測(cè)序，兩端各測(cè)一個(gè)反應(yīng)。測(cè)序時(shí)候把自己引物帶上10ul. |
8樓2014-06-08 23:15:46
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9樓2014-06-09 07:27:43
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