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angiexx新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
克隆活化小提質(zhì)粒相關(guān)問(wèn)題 已有1人參與
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一年多以前，克隆時(shí)挑一個(gè)白菌落到氨芐濃度為100μg/mL的LB培養(yǎng)基里搖菌，菌液測(cè)序后加甘油15%保存在-80℃，中途-80℃冰箱出故障，質(zhì)粒有在低于-80℃保存過(guò)1天后轉(zhuǎn)移到-20℃，現(xiàn)在想要活化質(zhì)粒，有幾個(gè)問(wèn)題想要請(qǐng)教大家： （1）質(zhì)粒保存低于-80℃（具體多少不知道）有影響嗎？ （2）活化時(shí)我看有人說(shuō)需要?jiǎng)澗�挑菌搖菌，我想請(qǐng)問(wèn)可以直接加甘油菌液到LB培養(yǎng)基里搖菌嗎？LB里需要加氨芐嗎？氨芐濃度還是多少呢？時(shí)間太久，質(zhì)粒上的氨芐抗性會(huì)不會(huì)丟失，加了氨芐會(huì)不會(huì)長(zhǎng)不出？ （3）活化搖菌的轉(zhuǎn)速時(shí)間多少呢?我有看到說(shuō)最好控制在對(duì)數(shù)期內(nèi)，13~16h，因?yàn)槲覀冎挥械娃D(zhuǎn)速的搖床，130rpm的話搖過(guò)夜（18h以上）可以嗎？ 綜上，就是想問(wèn)一下質(zhì)粒活化的操作方法，希望能詳細(xì)解答一下~剛開(kāi)始做這部分，還請(qǐng)大家多多指教~ |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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①無(wú)影響，而且建議低溫保存，但是要避免反復(fù)凍融。 ②可以直接加甘油菌液到LB培養(yǎng)基，但前提是甘油管菌種要品質(zhì)良好。若容易染菌，則需挑單克隆。活化時(shí)要加抗生素的，100μg/mL濃度就可以，我也是用的這個(gè)濃度。時(shí)間很久的話也要加抗生素，可能某些菌體丟失質(zhì)粒而失去抗性長(zhǎng)不出（不是質(zhì)粒上抗性丟失，而是丟失質(zhì)粒），但這不就是加氨芐抗生素的目的嗎？將含有質(zhì)粒的菌培養(yǎng)出來(lái)。 ③低轉(zhuǎn)速的搖床就可以的，這個(gè)影響的是培養(yǎng)基的含氧量，不過(guò)不是特別重要。 總之，我活化質(zhì)粒就是將之前-80保存的甘油菌在抗性培養(yǎng)基中按1%量加入，培養(yǎng)過(guò)夜，第二天抽質(zhì)粒。 另外，我還會(huì)在-80度單獨(dú)保存一管質(zhì)粒，以防這個(gè)甘油菌出現(xiàn)什么問(wèn)題~這樣我可以再做一次轉(zhuǎn)化就好了~ |
angiexx2樓2016-01-15 14:54:59
angiexx
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3樓2016-01-15 15:51:35
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請(qǐng)問(wèn)加了氨芐的LB培養(yǎng)基一直放在超凈臺(tái)里，用錫箔紙一直包起來(lái)遮光，放了四五天還可以用嗎？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
4樓2016-01-16 12:32:29
jinghonglxt
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