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angiexx新蟲 (初入文壇)
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[求助]
克隆活化小提質(zhì)粒相關(guān)問題 已有1人參與
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一年多以前，克隆時挑一個白菌落到氨芐濃度為100μg/mL的LB培養(yǎng)基里搖菌，菌液測序后加甘油15%保存在-80℃，中途-80℃冰箱出故障，質(zhì)粒有在低于-80℃保存過1天后轉(zhuǎn)移到-20℃，現(xiàn)在想要活化質(zhì)粒，有幾個問題想要請教大家： （1）質(zhì)粒保存低于-80℃（具體多少不知道）有影響嗎？ （2）活化時我看有人說需要劃線挑菌搖菌，我想請問可以直接加甘油菌液到LB培養(yǎng)基里搖菌嗎？LB里需要加氨芐嗎？氨芐濃度還是多少呢？時間太久，質(zhì)粒上的氨芐抗性會不會丟失，加了氨芐會不會長不出？ （3）活化搖菌的轉(zhuǎn)速時間多少呢?我有看到說最好控制在對數(shù)期內(nèi)，13~16h，因為我們只有低轉(zhuǎn)速的搖床，130rpm的話搖過夜（18h以上）可以嗎？ 綜上，就是想問一下質(zhì)粒活化的操作方法，希望能詳細(xì)解答一下~剛開始做這部分，還請大家多多指教~ |
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lifechuteng
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【答案】應(yīng)助回帖
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①無影響，而且建議低溫保存，但是要避免反復(fù)凍融。 ②可以直接加甘油菌液到LB培養(yǎng)基，但前提是甘油管菌種要品質(zhì)良好。若容易染菌，則需挑單克隆�；罨瘯r要加抗生素的，100μg/mL濃度就可以，我也是用的這個濃度。時間很久的話也要加抗生素，可能某些菌體丟失質(zhì)粒而失去抗性長不出（不是質(zhì)粒上抗性丟失，而是丟失質(zhì)粒），但這不就是加氨芐抗生素的目的嗎？將含有質(zhì)粒的菌培養(yǎng)出來。 ③低轉(zhuǎn)速的搖床就可以的，這個影響的是培養(yǎng)基的含氧量，不過不是特別重要。 總之，我活化質(zhì)粒就是將之前-80保存的甘油菌在抗性培養(yǎng)基中按1%量加入，培養(yǎng)過夜，第二天抽質(zhì)粒。 另外，我還會在-80度單獨保存一管質(zhì)粒，以防這個甘油菌出現(xiàn)什么問題~這樣我可以再做一次轉(zhuǎn)化就好了~ |
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angiexx2樓2016-01-15 14:54:59
angiexx
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4樓2016-01-16 12:32:29
jinghonglxt
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