 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 7 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 3299 | 回復(fù): 6 | |||
global.wun銀蟲 (正式寫手)
|
[交流]
【求助/交流】菌液PCR的經(jīng)驗(yàn) 已有5人參與
|
|
由于課題組所需，我需要構(gòu)建數(shù)量可觀的真核表達(dá)載體和融合載體 起初我也查到相關(guān)菌落PCR的文獻(xiàn)，和導(dǎo)師商量，導(dǎo)師一口回絕了 他的理由和我所搜集到的理由一樣：假陽(yáng)性 我們實(shí)驗(yàn)室一博士師姐需要做一個(gè)真核表達(dá)載體 挑選了60個(gè)菌落，運(yùn)用目的基因的上下游引物做PCR，出來(lái)?xiàng)l帶的有有52個(gè) 按照經(jīng)驗(yàn)選取比較亮的14個(gè)提取質(zhì)粒，酶切和PCR雙鑒定 結(jié)果僅有一個(gè)為陽(yáng)性克隆，其余均為假陽(yáng)性（假陽(yáng)性主要考慮來(lái)源于未與載體結(jié)合的插入片段） 也難怪老板一口回絕 只是我需要做的基因太多，最兇猛的時(shí)候我一個(gè)星期要用兩個(gè)200次的TianGen的質(zhì)粒小提，累死人不償命 后來(lái)我自己對(duì)著圖譜研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0載體、pCDNA3.1 myc his C載體和pEGFP載體） 下載 (44.67 KB) 2009-3-29 21:03 .0的MCS兩端有T7和SP6 如果我用T7和SP6作為引物，則 1.P出大小約150bp的片段，則為MCS序列，無(wú)插入片段 2,若有插入片段，則應(yīng)該為目的大小+152bp 如下圖所示： 下載 (14.26 KB) 2009-3-29 21:03 后再改進(jìn)為T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6 因?yàn)榧词褂肨7+SP6證明有插入但也不能確定為目的片段 這樣既解決了假陽(yáng)性也解決了基因的特異性問題 如下圖： 下載 (16.07 KB) 2009-3-29 21:03 總結(jié)如下： 1.PCR引物的選擇（ 此點(diǎn)至關(guān)重要，這也是菌液PCR的獨(dú)特魅力所在） 選擇一個(gè)載體上的特異性序列和一個(gè)目的基因上的特異性序列作為引物 如：pCDNA3.0載體：T7+目的基因-R 或SP6+目的基因-F pCDNA3.1 myc his C（只有上游T7無(wú)下游SP6）：T7+目的基因-R pEGFP（MCS兩側(cè)無(wú)通用序列）：自己設(shè)計(jì)靠近兩側(cè)的特異性引物（也可以求助于測(cè)序公司，如：上海英駿/Invitrogen，他們有絕大多數(shù)載體的測(cè)序用的引物序列） 仔細(xì)的閱讀你的載體圖，選擇針對(duì)陽(yáng)性重組子的特異性引物組合 2.菌落的處理（我用的是質(zhì)粒小提，用15ml離心管搖菌，通常加5ml培養(yǎng)基） 挑取新鮮菌落于含抗性的（LB）培養(yǎng)基中 37°C 200rpm搖床 搖2-4小時(shí)以上 （通常趕時(shí)間的 話我就在搖后3小時(shí)做，這時(shí)我的PCR循環(huán)數(shù)就要相應(yīng)多些，設(shè)置為32-35個(gè)循環(huán)，若不趕時(shí)間的話，我都是取搖過夜的活化菌做模板，此時(shí)我的PCR循環(huán)數(shù)就相應(yīng)少些，一般28-30個(gè)循環(huán)） 3.菌液的處理 無(wú)需特殊處理菌液 或 取1-2ul菌液稀釋為100倍體積，沸水浴10-15mins 甚至于在稀釋體系中按1/1000加triton（這個(gè)我沒做過） 提出加triton的人說這是為了破膜，以便能夠釋放出帶目的基因的質(zhì)粒，不過我覺得此步驟多次一舉，細(xì)胞膜在沸水浴中肯定會(huì)變形掉 我試過沸水浴15mins，其效果和無(wú)需處理的菌液（實(shí)際上我在PCR的體系上做了手腳，后述）近似，所以后來(lái)我就沒有再那么麻煩的去稀釋，煮沸 4.pcr體系：無(wú)特殊要求 同普通PCR，我一般使用20ul或25ul體系，鑒定用嘛，不用太鋪張，過少的體系也不推薦，除非你很信任你的“槍”和你的加樣的力度 5.模板的量：1-2ul 未處理的和處理過的菌液均可以加1-2ul作為模板，需要說明的是PCR的反應(yīng)是一個(gè)微量反應(yīng)，用于檢測(cè)10的負(fù)3-6次方級(jí)別，如果用未做任何處理的菌落來(lái)做PCR其量過于大，菌落通常都是10的6次方級(jí)別（因?yàn)槲铱吹阶罱幸惶且晃蝗市种苯佑镁渥瞿０�，我沒有做過驗(yàn)證，但從原理上來(lái)說是不推薦的） 6.退火溫度：55-58°C 此步我沒有詳細(xì)的論證，因?yàn)槲业哪康幕蛭叶甲鲞^梯度PCR，其退火溫度均可以用55°C或者58°C完成 T7，SP6的退火溫度400-900bp的產(chǎn)物大概為55° 我也有62度為最佳退火溫度的產(chǎn)物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的條帶 7.循環(huán)數(shù)：取決于模板的拷貝數(shù)，最少的我試過28個(gè)，最多的也不過35個(gè)，均可以P出來(lái) 8.預(yù)變形時(shí)間：因?yàn)橄酉♂尵褐蠓械倪^程很麻煩，所以后來(lái)我就直接取的活化菌液，考慮到的確可能細(xì)胞膜變形不完全，導(dǎo)致擴(kuò)增的模板未能完全釋放，以致擴(kuò)增效率降低，我將預(yù)變形的時(shí)間改為10-15mins，效果不錯(cuò) ，之前煮沸過的菌液自然不需要考慮這一步 以上就是學(xué)弟的一點(diǎn)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，絕大部分經(jīng)過自己的驗(yàn)證，如有覺得不妥的地方還請(qǐng)大家多多指正！ 再次高呼：菌液PCR在陽(yáng)性克隆的篩選中異常的方便和廉價(jià)，高度推崇！��！ P.S. 通過長(zhǎng)時(shí)間的魔鬼試驗(yàn)進(jìn)程，我現(xiàn)在基本可以做到用肉眼高精度的識(shí)別菌落，一般挑取的菌落90%以上均為陽(yáng)性菌落，所以這篇文章暫時(shí)定位于 小鳥級(jí)別的分生試驗(yàn)者，老鳥。。。嘿嘿，那就不用了，給大家看一張后來(lái)我做的菌液PCR的圖： 下載 (8.92 KB) 2009-3-29 21:03 這張圖上共有4個(gè)基因的重組子 除了第二個(gè)基因的第二個(gè)泳道有非特異性的產(chǎn)物，其他均為目的條帶 補(bǔ)充說明如下： 鑒于很多同仁提到的假陽(yáng)性的問題 我補(bǔ)充說明一下 1.我需要做菌液PCR的目的是為了選取基因重組中的陽(yáng)性克隆 如果只是鑒定已獲取的陽(yáng)性質(zhì)�；蚴菙U(kuò)增 則不存在假陽(yáng)性一說 2.我后面也補(bǔ)充說明了 通過調(diào)整合適的插入片段和載體的比例，基本上可以使得每個(gè)長(zhǎng)出的菌落均為陽(yáng)性菌落 貼一張比例很合適連接之后的圖 下載 (82.17 KB) 2009-3-29 21:03 圖片上全部為大菌落，這些菌落我全做了PCR和酶切鑒定，全部含有目的片段 后一組我后來(lái)通過濃度梯度做出來(lái)的圖片 插入片段和載體的mol比分別為4:1，7:1，10:1 下載 (92.21 KB) 2009-3-29 21:03 下載 (113.15 KB) 2009-3-29 21:03 下載 (100.87 KB) 2009-3-29 21:03 3種比率中7：1的是陽(yáng)性連接比率最高的 4：1的空載體最多 所以，我想強(qiáng)調(diào)的是： 通過調(diào)整合適的插入片段和載體的mol比例 是可以完全做到長(zhǎng)出的菌落全部為陽(yáng)性菌落的 另外，在挑取菌落的時(shí)候也是有講究的 對(duì)于陽(yáng)性菌落和無(wú)插入片段的載體菌落大小上是有一定區(qū)別的 我在文章后來(lái)提到的通過選擇具有一定特征的菌落以達(dá)到很高的陽(yáng)性率也是可以做到的就是這個(gè)意思 我想通過這些手段也完全可以使菌液PCR顯得多余 所以我在文章的開頭也說了 這篇文章應(yīng)該是適合各位新手開始做重組時(shí)候的方法 最后還有一個(gè)因素就是大家做重組的步驟上或許也有一些原因 我用的是Invitrogen的T4 DNA ligase 條件：26°C 2-4h （我知道最好是16度過夜，只是苦于我們這里的實(shí)驗(yàn)室老師不讓我們用PCR儀過夜，其他的設(shè)備又不能維持穩(wěn)定的溫度，且還和室溫有關(guān)） 轉(zhuǎn)化：取1-2ul轉(zhuǎn)化20ulTop10感受態(tài)細(xì)胞 最后取150ul涂板，37°C過夜 中間我也冥思苦想，考慮假陽(yáng)性的源頭 最后考慮到的唯一的可能就是來(lái)自于未能和載體連接上的插入片段 我是直接取的連接產(chǎn)物去做轉(zhuǎn)化 （Invitrogen推薦的是將連接產(chǎn)物稀釋至少10倍以上之后取2ul轉(zhuǎn)化） 自然這部分未能連接上的片段也被帶入到擴(kuò)增體系中 最后這部分微量的插入片段被PCR儀擴(kuò)增出來(lái) 不知各位前輩是否有更好的建議 我的這篇文章全當(dāng)是拋磚引玉 各位對(duì)菌液PCR有什么更好的提議的多多提出來(lái) p.s. 一直在螺旋網(wǎng)當(dāng)看客，學(xué)習(xí)技術(shù) 自己構(gòu)建載體也有6個(gè)月了 總共構(gòu)建了54個(gè)陽(yáng)性載體用于后續(xù)的研究 中間許多心酸自不必說 最近處于收尾和交接后續(xù)工作的時(shí)刻 昨晚興起才想起該為大家留點(diǎn)東西 今天看到自己的帖子上了螺旋網(wǎng)首頁(yè) 哈哈 ，心里還是很比較感激這長(zhǎng)時(shí)間老板的壓迫的哈 謝謝大家的關(guān)注 后面補(bǔ)上來(lái)的菌落的圖是我今天臨時(shí)照的 由于板子放在4°C冰箱有一段時(shí)間了 所以周圍長(zhǎng)了一些衛(wèi)星灶 還請(qǐng)見諒哦 來(lái)源網(wǎng)址：www.yiqi120.com/zlzx.asp |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有206人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 關(guān)于菌液PCR的DNA模板制備，
已經(jīng)有4人回復(fù)
- pfu擴(kuò)增，菌液PCR問題
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 菌液PCR是陽(yáng)性，卻提不出來(lái)陽(yáng)性質(zhì)粒！求助
已經(jīng)有31人回復(fù)
- 求幫忙分析下菌液PCR檢測(cè)結(jié)果
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 菌液PCR驗(yàn)證又失敗了
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 菌液PCR驗(yàn)證
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 請(qǐng)教：菌液pcr帶總是很弱，為什么？
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 膠回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后菌液PCR電泳條帶出現(xiàn)問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【求助/交流】菌液PCR問題
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆時(shí)，總出現(xiàn)CK
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于農(nóng)桿菌菌液PCR
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 【求助/交流】菌液PCR結(jié)束，肉眼直接看到條帶可能不？
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 【求助/交流】有關(guān)菌液PCR的問題
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】菌液PCR，求助。
已經(jīng)有8人回復(fù)
xp198766
鐵桿木蟲 (著名寫手)
小木蟲職業(yè)打醬油滴~~！
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 6525.1
- 散金: 262
- 紅花: 25
- 帖子: 2193
- 在線: 554小時(shí)
- 蟲號(hào): 1046859
- 注冊(cè): 2010-06-24
- 性別: GG
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學(xué)
2樓2010-08-19 15:41:11
三磷酸腺苷
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
- MolEPI: 7
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 貴賓: 0.021
- 金幣: 7298.5
- 散金: 9
- 紅花: 13
- 帖子: 4032
- 在線: 224.7小時(shí)
- 蟲號(hào): 551611
- 注冊(cè): 2008-04-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤（含特殊感受
茍雅玲3樓2010-08-19 16:03:21
三磷酸腺苷
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
- MolEPI: 7
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 貴賓: 0.021
- 金幣: 7298.5
- 散金: 9
- 紅花: 13
- 帖子: 4032
- 在線: 224.7小時(shí)
- 蟲號(hào): 551611
- 注冊(cè): 2008-04-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤（含特殊感受
4樓2010-08-19 16:06:25
,這文章說的什么啊，到底是求助？還是講解啊。。。 5樓2014-03-23 22:49:19
tu475575025
新蟲 (小有名氣)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 416.1
- 紅花: 2
- 帖子: 70
- 在線: 41小時(shí)
- 蟲號(hào): 2003636
- 注冊(cè): 2012-09-15
- 專業(yè): 生物信息學(xué)
6樓2014-03-24 13:51:16
茍雅玲
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 186.3
- 帖子: 28
- 在線: 42.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 2061465
- 注冊(cè): 2012-10-14
- 性別: MM
- 專業(yè): 環(huán)境污染化學(xué)
7樓2017-04-12 11:12:50
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 global.wun 的主題更新
| 7 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿中國(guó)石油大學(xué)（華東） 本科齊魯工業(yè)大學(xué) +4 | 石能偉 2026-03-17 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研]
 0854 考研調(diào)劑 招生了！AI 方向
+3
|
pk3725069 2026-03-19 | 14/700 |
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +8 | 上岸6666@ 2026-03-20 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +6 | 87639 2026-03-21 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 一志愿中南大學(xué)化學(xué)學(xué)碩0703總分337求調(diào)劑 +4 | niko- 2026-03-22 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿武理材料工程348求調(diào)劑 +5 | ￣^￣゜汗 2026-03-19 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +6 | shansx 2026-03-22 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 初試 317 +7 | 半拉月丙 2026-03-20 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿重慶大學(xué)085700資源與環(huán)境總分308求調(diào)劑 +7 | 墨墨漠 2026-03-20 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +9 | 簡(jiǎn)單點(diǎn)0 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 南昌大學(xué)材料專碩311分求調(diào)劑 +6 | 77chaselx 2026-03-20 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿山大07化學(xué) 332分 四六級(jí)已過 本科山東雙非 求調(diào)劑！ +3 | 不想理你 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 初始318分求調(diào)劑（有工作經(jīng)驗(yàn)） +3 | 1911236844 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿重慶大學(xué)085700資源與環(huán)境專碩，總分308求調(diào)劑 +3 | 墨墨漠 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +10 | S.H1 2026-03-18 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +3 | 阿姐阿姐家啊 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 317求調(diào)劑 +5 | 申子申申 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)求調(diào)劑 +4 | Stella_Yao 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 招收調(diào)劑碩士 +4 | lidianxing 2026-03-19 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 材料考研調(diào)劑 +3 | xwt。 2026-03-19 | 3/150 |
|