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global.wun銀蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】菌液PCR的經(jīng)驗(yàn) 已有5人參與
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由于課題組所需，我需要構(gòu)建數(shù)量可觀的真核表達(dá)載體和融合載體 起初我也查到相關(guān)菌落PCR的文獻(xiàn)，和導(dǎo)師商量，導(dǎo)師一口回絕了 他的理由和我所搜集到的理由一樣：假陽(yáng)性 我們實(shí)驗(yàn)室一博士師姐需要做一個(gè)真核表達(dá)載體 挑選了60個(gè)菌落，運(yùn)用目的基因的上下游引物做PCR，出來(lái)?xiàng)l帶的有有52個(gè) 按照經(jīng)驗(yàn)選取比較亮的14個(gè)提取質(zhì)粒，酶切和PCR雙鑒定 結(jié)果僅有一個(gè)為陽(yáng)性克隆，其余均為假陽(yáng)性（假陽(yáng)性主要考慮來(lái)源于未與載體結(jié)合的插入片段） 也難怪老板一口回絕 只是我需要做的基因太多，最兇猛的時(shí)候我一個(gè)星期要用兩個(gè)200次的TianGen的質(zhì)粒小提，累死人不償命 后來(lái)我自己對(duì)著圖譜研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0載體、pCDNA3.1 myc his C載體和pEGFP載體） 下載 (44.67 KB) 2009-3-29 21:03 .0的MCS兩端有T7和SP6 如果我用T7和SP6作為引物，則 1.P出大小約150bp的片段，則為MCS序列，無(wú)插入片段 2,若有插入片段，則應(yīng)該為目的大小+152bp 如下圖所示： 下載 (14.26 KB) 2009-3-29 21:03 后再改進(jìn)為T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6 因?yàn)榧词褂肨7+SP6證明有插入但也不能確定為目的片段 這樣既解決了假陽(yáng)性也解決了基因的特異性問(wèn)題 如下圖： 下載 (16.07 KB) 2009-3-29 21:03 總結(jié)如下： 1.PCR引物的選擇（ 此點(diǎn)至關(guān)重要，這也是菌液PCR的獨(dú)特魅力所在） 選擇一個(gè)載體上的特異性序列和一個(gè)目的基因上的特異性序列作為引物 如：pCDNA3.0載體：T7+目的基因-R 或SP6+目的基因-F pCDNA3.1 myc his C（只有上游T7無(wú)下游SP6）：T7+目的基因-R pEGFP（MCS兩側(cè)無(wú)通用序列）：自己設(shè)計(jì)靠近兩側(cè)的特異性引物（也可以求助于測(cè)序公司，如：上海英駿/Invitrogen，他們有絕大多數(shù)載體的測(cè)序用的引物序列） 仔細(xì)的閱讀你的載體圖，選擇針對(duì)陽(yáng)性重組子的特異性引物組合 2.菌落的處理（我用的是質(zhì)粒小提，用15ml離心管搖菌，通常加5ml培養(yǎng)基） 挑取新鮮菌落于含抗性的（LB）培養(yǎng)基中 37°C 200rpm搖床 搖2-4小時(shí)以上 （通常趕時(shí)間的 話我就在搖后3小時(shí)做，這時(shí)我的PCR循環(huán)數(shù)就要相應(yīng)多些，設(shè)置為32-35個(gè)循環(huán)，若不趕時(shí)間的話，我都是取搖過(guò)夜的活化菌做模板，此時(shí)我的PCR循環(huán)數(shù)就相應(yīng)少些，一般28-30個(gè)循環(huán)） 3.菌液的處理 無(wú)需特殊處理菌液 或 取1-2ul菌液稀釋為100倍體積，沸水浴10-15mins 甚至于在稀釋體系中按1/1000加triton（這個(gè)我沒(méi)做過(guò)） 提出加triton的人說(shuō)這是為了破膜，以便能夠釋放出帶目的基因的質(zhì)粒，不過(guò)我覺(jué)得此步驟多次一舉，細(xì)胞膜在沸水浴中肯定會(huì)變形掉 我試過(guò)沸水浴15mins，其效果和無(wú)需處理的菌液（實(shí)際上我在PCR的體系上做了手腳，后述）近似，所以后來(lái)我就沒(méi)有再那么麻煩的去稀釋，煮沸 4.pcr體系：無(wú)特殊要求 同普通PCR，我一般使用20ul或25ul體系，鑒定用嘛，不用太鋪張，過(guò)少的體系也不推薦，除非你很信任你的“槍”和你的加樣的力度 5.模板的量：1-2ul 未處理的和處理過(guò)的菌液均可以加1-2ul作為模板，需要說(shuō)明的是PCR的反應(yīng)是一個(gè)微量反應(yīng)，用于檢測(cè)10的負(fù)3-6次方級(jí)別，如果用未做任何處理的菌落來(lái)做PCR其量過(guò)于大，菌落通常都是10的6次方級(jí)別（因?yàn)槲铱吹阶罱幸惶且晃蝗市种苯佑镁渥瞿０�，我沒(méi)有做過(guò)驗(yàn)證，但從原理上來(lái)說(shuō)是不推薦的） 6.退火溫度：55-58°C 此步我沒(méi)有詳細(xì)的論證，因?yàn)槲业哪康幕蛭叶甲鲞^(guò)梯度PCR，其退火溫度均可以用55°C或者58°C完成 T7，SP6的退火溫度400-900bp的產(chǎn)物大概為55° 我也有62度為最佳退火溫度的產(chǎn)物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的條帶 7.循環(huán)數(shù)：取決于模板的拷貝數(shù)，最少的我試過(guò)28個(gè)，最多的也不過(guò)35個(gè)，均可以P出來(lái) 8.預(yù)變形時(shí)間：因?yàn)橄酉♂尵褐蠓械倪^(guò)程很麻煩，所以后來(lái)我就直接取的活化菌液，考慮到的確可能細(xì)胞膜變形不完全，導(dǎo)致擴(kuò)增的模板未能完全釋放，以致擴(kuò)增效率降低，我將預(yù)變形的時(shí)間改為10-15mins，效果不錯(cuò) ，之前煮沸過(guò)的菌液自然不需要考慮這一步 以上就是學(xué)弟的一點(diǎn)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，絕大部分經(jīng)過(guò)自己的驗(yàn)證，如有覺(jué)得不妥的地方還請(qǐng)大家多多指正！ 再次高呼：菌液PCR在陽(yáng)性克隆的篩選中異常的方便和廉價(jià)，高度推崇！��！ P.S. 通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的魔鬼試驗(yàn)進(jìn)程，我現(xiàn)在基本可以做到用肉眼高精度的識(shí)別菌落，一般挑取的菌落90%以上均為陽(yáng)性菌落，所以這篇文章暫時(shí)定位于 小鳥級(jí)別的分生試驗(yàn)者，老鳥。。。嘿嘿，那就不用了，給大家看一張后來(lái)我做的菌液PCR的圖： 下載 (8.92 KB) 2009-3-29 21:03 這張圖上共有4個(gè)基因的重組子 除了第二個(gè)基因的第二個(gè)泳道有非特異性的產(chǎn)物，其他均為目的條帶 補(bǔ)充說(shuō)明如下： 鑒于很多同仁提到的假陽(yáng)性的問(wèn)題 我補(bǔ)充說(shuō)明一下 1.我需要做菌液PCR的目的是為了選取基因重組中的陽(yáng)性克隆 如果只是鑒定已獲取的陽(yáng)性質(zhì)�；蚴菙U(kuò)增 則不存在假陽(yáng)性一說(shuō) 2.我后面也補(bǔ)充說(shuō)明了 通過(guò)調(diào)整合適的插入片段和載體的比例，基本上可以使得每個(gè)長(zhǎng)出的菌落均為陽(yáng)性菌落 貼一張比例很合適連接之后的圖 下載 (82.17 KB) 2009-3-29 21:03 圖片上全部為大菌落，這些菌落我全做了PCR和酶切鑒定，全部含有目的片段 后一組我后來(lái)通過(guò)濃度梯度做出來(lái)的圖片 插入片段和載體的mol比分別為4:1，7:1，10:1 下載 (92.21 KB) 2009-3-29 21:03 下載 (113.15 KB) 2009-3-29 21:03 下載 (100.87 KB) 2009-3-29 21:03 3種比率中7：1的是陽(yáng)性連接比率最高的 4：1的空載體最多 所以，我想強(qiáng)調(diào)的是： 通過(guò)調(diào)整合適的插入片段和載體的mol比例 是可以完全做到長(zhǎng)出的菌落全部為陽(yáng)性菌落的 另外，在挑取菌落的時(shí)候也是有講究的 對(duì)于陽(yáng)性菌落和無(wú)插入片段的載體菌落大小上是有一定區(qū)別的 我在文章后來(lái)提到的通過(guò)選擇具有一定特征的菌落以達(dá)到很高的陽(yáng)性率也是可以做到的就是這個(gè)意思 我想通過(guò)這些手段也完全可以使菌液PCR顯得多余 所以我在文章的開(kāi)頭也說(shuō)了 這篇文章應(yīng)該是適合各位新手開(kāi)始做重組時(shí)候的方法 最后還有一個(gè)因素就是大家做重組的步驟上或許也有一些原因 我用的是Invitrogen的T4 DNA ligase 條件：26°C 2-4h （我知道最好是16度過(guò)夜，只是苦于我們這里的實(shí)驗(yàn)室老師不讓我們用PCR儀過(guò)夜，其他的設(shè)備又不能維持穩(wěn)定的溫度，且還和室溫有關(guān)） 轉(zhuǎn)化：取1-2ul轉(zhuǎn)化20ulTop10感受態(tài)細(xì)胞 最后取150ul涂板，37°C過(guò)夜 中間我也冥思苦想，考慮假陽(yáng)性的源頭 最后考慮到的唯一的可能就是來(lái)自于未能和載體連接上的插入片段 我是直接取的連接產(chǎn)物去做轉(zhuǎn)化 （Invitrogen推薦的是將連接產(chǎn)物稀釋至少10倍以上之后取2ul轉(zhuǎn)化） 自然這部分未能連接上的片段也被帶入到擴(kuò)增體系中 最后這部分微量的插入片段被PCR儀擴(kuò)增出來(lái) 不知各位前輩是否有更好的建議 我的這篇文章全當(dāng)是拋磚引玉 各位對(duì)菌液PCR有什么更好的提議的多多提出來(lái) p.s. 一直在螺旋網(wǎng)當(dāng)看客，學(xué)習(xí)技術(shù) 自己構(gòu)建載體也有6個(gè)月了 總共構(gòu)建了54個(gè)陽(yáng)性載體用于后續(xù)的研究 中間許多心酸自不必說(shuō) 最近處于收尾和交接后續(xù)工作的時(shí)刻 昨晚興起才想起該為大家留點(diǎn)東西 今天看到自己的帖子上了螺旋網(wǎng)首頁(yè) 哈哈 ，心里還是很比較感激這長(zhǎng)時(shí)間老板的壓迫的哈 謝謝大家的關(guān)注 后面補(bǔ)上來(lái)的菌落的圖是我今天臨時(shí)照的 由于板子放在4°C冰箱有一段時(shí)間了 所以周圍長(zhǎng)了一些衛(wèi)星灶 還請(qǐng)見(jiàn)諒哦 來(lái)源網(wǎng)址：www.yiqi120.com/zlzx.asp |
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三磷酸腺苷
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茍雅玲3樓2010-08-19 16:03:21
xp198766
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小木蟲職業(yè)打醬油滴~~！
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2樓2010-08-19 15:41:11
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4樓2010-08-19 16:06:25
,這文章說(shuō)的什么啊，到底是求助？還是講解啊。。。 5樓2014-03-23 22:49:19
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