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[交流]
【求助/交流】菌液PCR的經(jīng)驗 已有5人參與
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由于課題組所需，我需要構建數(shù)量可觀的真核表達載體和融合載體 起初我也查到相關菌落PCR的文獻，和導師商量，導師一口回絕了 他的理由和我所搜集到的理由一樣：假陽性 我們實驗室一博士師姐需要做一個真核表達載體 挑選了60個菌落，運用目的基因的上下游引物做PCR，出來條帶的有有52個 按照經(jīng)驗選取比較亮的14個提取質粒，酶切和PCR雙鑒定 結果僅有一個為陽性克隆，其余均為假陽性（假陽性主要考慮來源于未與載體結合的插入片段） 也難怪老板一口回絕 只是我需要做的基因太多，最兇猛的時候我一個星期要用兩個200次的TianGen的質粒小提，累死人不償命 后來我自己對著圖譜研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0載體、pCDNA3.1 myc his C載體和pEGFP載體） 下載 (44.67 KB) 2009-3-29 21:03 .0的MCS兩端有T7和SP6 如果我用T7和SP6作為引物，則 1.P出大小約150bp的片段，則為MCS序列，無插入片段 2,若有插入片段，則應該為目的大小+152bp 如下圖所示： 下載 (14.26 KB) 2009-3-29 21:03 后再改進為T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6 因為即使用T7+SP6證明有插入但也不能確定為目的片段 這樣既解決了假陽性也解決了基因的特異性問題 如下圖： 下載 (16.07 KB) 2009-3-29 21:03 總結如下： 1.PCR引物的選擇（ 此點至關重要，這也是菌液PCR的獨特魅力所在） 選擇一個載體上的特異性序列和一個目的基因上的特異性序列作為引物 如：pCDNA3.0載體：T7+目的基因-R 或SP6+目的基因-F pCDNA3.1 myc his C（只有上游T7無下游SP6）：T7+目的基因-R pEGFP（MCS兩側無通用序列）：自己設計靠近兩側的特異性引物（也可以求助于測序公司，如：上海英駿/Invitrogen，他們有絕大多數(shù)載體的測序用的引物序列） 仔細的閱讀你的載體圖，選擇針對陽性重組子的特異性引物組合 2.菌落的處理（我用的是質粒小提，用15ml離心管搖菌，通常加5ml培養(yǎng)基） 挑取新鮮菌落于含抗性的（LB）培養(yǎng)基中 37°C 200rpm搖床 搖2-4小時以上 （通常趕時間的 話我就在搖后3小時做，這時我的PCR循環(huán)數(shù)就要相應多些，設置為32-35個循環(huán)，若不趕時間的話，我都是取搖過夜的活化菌做模板，此時我的PCR循環(huán)數(shù)就相應少些，一般28-30個循環(huán)） 3.菌液的處理 無需特殊處理菌液 或 取1-2ul菌液稀釋為100倍體積，沸水浴10-15mins 甚至于在稀釋體系中按1/1000加triton（這個我沒做過） 提出加triton的人說這是為了破膜，以便能夠釋放出帶目的基因的質粒，不過我覺得此步驟多次一舉，細胞膜在沸水浴中肯定會變形掉 我試過沸水浴15mins，其效果和無需處理的菌液（實際上我在PCR的體系上做了手腳，后述）近似，所以后來我就沒有再那么麻煩的去稀釋，煮沸 4.pcr體系：無特殊要求 同普通PCR，我一般使用20ul或25ul體系，鑒定用嘛，不用太鋪張，過少的體系也不推薦，除非你很信任你的“槍”和你的加樣的力度 5.模板的量：1-2ul 未處理的和處理過的菌液均可以加1-2ul作為模板，需要說明的是PCR的反應是一個微量反應，用于檢測10的負3-6次方級別，如果用未做任何處理的菌落來做PCR其量過于大，菌落通常都是10的6次方級別（因為我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我沒有做過驗證，但從原理上來說是不推薦的） 6.退火溫度：55-58°C 此步我沒有詳細的論證，因為我的目的基因我都做過梯度PCR，其退火溫度均可以用55°C或者58°C完成 T7，SP6的退火溫度400-900bp的產(chǎn)物大概為55° 我也有62度為最佳退火溫度的產(chǎn)物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的條帶 7.循環(huán)數(shù)：取決于模板的拷貝數(shù)，最少的我試過28個，最多的也不過35個，均可以P出來 8.預變形時間：因為嫌稀釋菌液煮沸的過程很麻煩，所以后來我就直接取的活化菌液，考慮到的確可能細胞膜變形不完全，導致擴增的模板未能完全釋放，以致擴增效率降低，我將預變形的時間改為10-15mins，效果不錯 ，之前煮沸過的菌液自然不需要考慮這一步 以上就是學弟的一點個人經(jīng)驗，絕大部分經(jīng)過自己的驗證，如有覺得不妥的地方還請大家多多指正！ 再次高呼：菌液PCR在陽性克隆的篩選中異常的方便和廉價，高度推崇�。。� P.S. 通過長時間的魔鬼試驗進程，我現(xiàn)在基本可以做到用肉眼高精度的識別菌落，一般挑取的菌落90%以上均為陽性菌落，所以這篇文章暫時定位于 小鳥級別的分生試驗者，老鳥。。。嘿嘿，那就不用了，給大家看一張后來我做的菌液PCR的圖： 下載 (8.92 KB) 2009-3-29 21:03 這張圖上共有4個基因的重組子 除了第二個基因的第二個泳道有非特異性的產(chǎn)物，其他均為目的條帶 補充說明如下： 鑒于很多同仁提到的假陽性的問題 我補充說明一下 1.我需要做菌液PCR的目的是為了選取基因重組中的陽性克隆 如果只是鑒定已獲取的陽性質�；蚴菙U增 則不存在假陽性一說 2.我后面也補充說明了 通過調整合適的插入片段和載體的比例，基本上可以使得每個長出的菌落均為陽性菌落 貼一張比例很合適連接之后的圖 下載 (82.17 KB) 2009-3-29 21:03 圖片上全部為大菌落，這些菌落我全做了PCR和酶切鑒定，全部含有目的片段 后一組我后來通過濃度梯度做出來的圖片 插入片段和載體的mol比分別為4:1，7:1，10:1 下載 (92.21 KB) 2009-3-29 21:03 下載 (113.15 KB) 2009-3-29 21:03 下載 (100.87 KB) 2009-3-29 21:03 3種比率中7：1的是陽性連接比率最高的 4：1的空載體最多 所以，我想強調的是： 通過調整合適的插入片段和載體的mol比例 是可以完全做到長出的菌落全部為陽性菌落的 另外，在挑取菌落的時候也是有講究的 對于陽性菌落和無插入片段的載體菌落大小上是有一定區(qū)別的 我在文章后來提到的通過選擇具有一定特征的菌落以達到很高的陽性率也是可以做到的就是這個意思 我想通過這些手段也完全可以使菌液PCR顯得多余 所以我在文章的開頭也說了 這篇文章應該是適合各位新手開始做重組時候的方法 最后還有一個因素就是大家做重組的步驟上或許也有一些原因 我用的是Invitrogen的T4 DNA ligase 條件：26°C 2-4h （我知道最好是16度過夜，只是苦于我們這里的實驗室老師不讓我們用PCR儀過夜，其他的設備又不能維持穩(wěn)定的溫度，且還和室溫有關） 轉化：取1-2ul轉化20ulTop10感受態(tài)細胞 最后取150ul涂板，37°C過夜 中間我也冥思苦想，考慮假陽性的源頭 最后考慮到的唯一的可能就是來自于未能和載體連接上的插入片段 我是直接取的連接產(chǎn)物去做轉化 （Invitrogen推薦的是將連接產(chǎn)物稀釋至少10倍以上之后取2ul轉化） 自然這部分未能連接上的片段也被帶入到擴增體系中 最后這部分微量的插入片段被PCR儀擴增出來 不知各位前輩是否有更好的建議 我的這篇文章全當是拋磚引玉 各位對菌液PCR有什么更好的提議的多多提出來 p.s. 一直在螺旋網(wǎng)當看客，學習技術 自己構建載體也有6個月了 總共構建了54個陽性載體用于后續(xù)的研究 中間許多心酸自不必說 最近處于收尾和交接后續(xù)工作的時刻 昨晚興起才想起該為大家留點東西 今天看到自己的帖子上了螺旋網(wǎng)首頁 哈哈 ，心里還是很比較感激這長時間老板的壓迫的哈 謝謝大家的關注 后面補上來的菌落的圖是我今天臨時照的 由于板子放在4°C冰箱有一段時間了 所以周圍長了一些衛(wèi)星灶 還請見諒哦 來源網(wǎng)址：www.yiqi120.com/zlzx.asp |
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茍雅玲
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