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左旋安菲版主
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[求助]
蛋白純化時 NI柱可能進氣 如何修復柱子？
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FPLC純化蛋白 上樣的時候 沒留意 發(fā)現樣品管空了 我記得我一分鐘以前我發(fā)現樣品很多的 可能是我進樣速度大吧:2.5mL/min 我立刻結束了程序 然后想用水沖 發(fā)現系統(tǒng)沒壓力 然后我拆了柱子 發(fā)現柱子上面的管子里面沒有液體 然后我用pumpwash 然后想重新上樣蛋白 發(fā)現系統(tǒng)依然沒有壓力 然后我就去找一個博士幫忙 博士幫忙用注射器抽了系統(tǒng)的氣體 但是他說不確定柱子是否進氣 我現在有點擔心柱子是否進氣 如果進氣，如何處理來拯救柱子？ 補充：系統(tǒng)排出氣體后，我沒有處理柱子，就繼續(xù)上樣了 然后蛋白純化后 發(fā)現樣品（豬的蛋白）出峰的位置和我以前做的別的物種（雞的蛋白）不一樣。大峰大概出在第二個和第三個梯度之間，而原來雞的蛋白的出峰位置在最后一個梯度，而最后一個梯度的時候，這次僅僅是一個小峰。 后來我把這次蛋白純化的大峰和小峰全部跑SDS-PAGE膠，發(fā)現全部都是目的蛋白，都有雜帶。但是大峰出的蛋白濃，雜帶明顯；小峰出的蛋白弱，雜帶不明顯。（但是有師兄說小峰估計也有雜帶，只是因為純度弱） 為什么要補充這個，是因為有師兄說，如果蛋白跑膠后，有雜帶，說明這個柱子柱效就不是很好了。 我不是很懂，所以全部寫出來。 希望大家多多幫忙，指出如果進氣，柱子會怎樣？是否能從蛋白中看出來？ 另外，最重要的是如何修復柱子？ 我有個師姐說用無水乙醇大量沖洗？ 謝謝。 |
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4樓2017-10-26 21:54:34
a381261023
實習版主
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2樓2011-08-29 10:52:02
冼亮淀粉酶
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【答案】應助回帖
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lstt09nk(金幣+8, BioEPI+1): 感謝交流 2011-08-29 17:05:27
左旋安菲(金幣+90): 謝謝 我的鎳柱是預裝柱 好像不透明 我們用的fplc是GE公司的，好像也是AKTK的。不過我后來已經把這個柱子繼續(xù)上樣 純化蛋白了 我回頭再看一下吧 2011-08-31 01:51:03
lstt09nk(金幣+8, BioEPI+1): 感謝交流 2011-08-29 17:05:27
左旋安菲(金幣+90): 謝謝 我的鎳柱是預裝柱 好像不透明 我們用的fplc是GE公司的，好像也是AKTK的。不過我后來已經把這個柱子繼續(xù)上樣 純化蛋白了 我回頭再看一下吧 2011-08-31 01:51:03
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鎳柱是親和層析，6個組氨酸標簽，但是也不一定都沒有雜帶的，多多少少都會有，一步就到95%純度極其艱難，這跟柱效關系不大。如果覺得不夠純，就用第一次純化之后的蛋白質作為樣品進行第二次純化，會比第一次純化之后更純一些，但純度能達到什么程度也是運氣問題。 你的鎳柱是預裝柱？裝填料的容器不是透明的？如果是透明的，填料進了氣泡之后，填料之間的空隙會比沒有空隙的地方白，一眼就看出來了。 因為你是在上樣品的時候進空氣，所以你應該用上樣緩沖液來沖洗，最好別用20%乙醇，因為層析柱的溶劑更換有個原則，就是要確保溶劑之間不要起反應，所以進空氣的時候溶劑能不換就最好不換，因為樣品所處的起始液和20%乙醇是不同的。你用起始液沖洗10個柱床體積之后，空氣應該就差不多跑掉了，可以正常洗脫了。 我用AKTA如果進了空氣很容易處理，因為管道都是透明的，不知道FPLC的管道是不是透明的。FPLC說是流速更大，更耐壓，其實層析的時候流速太大對蛋白質分離是極其不利的。 我用AKTA得出的結論，你權衡一下，合適就用，不合適就別用。 |
3樓2011-08-29 16:23:41
5樓2018-07-31 18:31:14
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