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yanhui8558金蟲 (小有名氣)
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[求助]
his標(biāo)簽蛋白純化，不掛柱 已有1人參與
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我一直在用大腸桿菌表達(dá)一個蛋白激酶，用pet21a載體，用過超聲破碎和先溶菌酶處理和超聲處理破碎。結(jié)果蛋白主要在沉淀中，上清中的量不多但還可以，主要問題是不怎么掛鎳柱，用PBS平衡柱子，PH8.0, 30mM咪唑洗雜蛋白，250mM咪唑洗脫，跑蛋白電泳和western都是穿過液和上清條帶都差不多，很苦惱， 有沒有高人指點一下啊。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
yanhui8558(金幣+2): 2011-07-14 17:02:13
lstt09nk(金幣+3): 辛苦，感謝交流，歡迎常來 2011-07-17 20:22:27
yanhui8558(金幣+2): 2011-07-14 17:02:13
lstt09nk(金幣+3): 辛苦，感謝交流，歡迎常來 2011-07-17 20:22:27
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The reasons may be: • Elution conditions are too mild (histidine-tagged protein still bound): Elute with an increasing imidazole gradient or decreasing pH to determine the optimal elution conditions. • The protein has precipitated in the column: Try detergents or changed NaCl concentration or elute under denaturing (unfolding) conditions (use 4–8 M urea or 4–6 M Gua-HCl) to remove precipitated proteins. For the next experiment, decrease amount of sample, or decrease protein concentration by eluting with a linear imidazole gradient instead of imidazole steps. • Nonspecific hydrophobic or other interaction: Add a nonionic detergent to the elution buffer (e.g. 0.2% Triton X-100) or change the NaCl concentration. • Concentration of imidazole in the sample and/or binding buffer is too high: The protein is found in the flowthrough material. Decrease the imidazole concentration. • Target protein may not be histidine-tagged as expected: Verify DNA sequence of the gene. Analyze samples taken before and after induction of expression with, for example, anti-His antibodies in Western blotting. • Histidine-tag may be insufficiently exposed: The protein is found in the flowthrough material. Perform purification of unfolded protein in urea or Gua-HCl as for inclusion bodies. |
5樓2011-07-14 16:44:28
14樓2014-03-27 10:50:55
zx1984
木蟲 (正式寫手)
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2樓2011-07-11 19:13:05
nnxqwei
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yanhui8558
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8樓2011-07-18 11:29:07
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9樓2011-07-18 11:29:55
【答案】應(yīng)助回帖
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yanhui8558(金幣+1): 2011-08-02 09:45:04
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一方面提高可溶性的，對誘導(dǎo)條件進(jìn)行摸索，如溫度，誘導(dǎo)劑濃度。還可以嘗試改變一下表達(dá)載體。另一方面進(jìn)行純化時，可以改變his tag的位置，也可以適當(dāng)提高樹脂的量，或者增大菌體量試一試。若是一點也純化不出來，很有可能是his tag 被包埋在蛋白空間結(jié)構(gòu)中，那建議還是利用變復(fù)性吧！ |
10樓2011-07-18 22:22:20
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