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左旋安菲實(shí)習(xí)版主
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[求助]
蛋白純化時(shí) NI柱可能進(jìn)氣 如何修復(fù)柱子？
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FPLC純化蛋白 上樣的時(shí)候 沒(méi)留意 發(fā)現(xiàn)樣品管空了 我記得我一分鐘以前我發(fā)現(xiàn)樣品很多的 可能是我進(jìn)樣速度大吧:2.5mL/min 我立刻結(jié)束了程序 然后想用水沖 發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)沒(méi)壓力 然后我拆了柱子 發(fā)現(xiàn)柱子上面的管子里面沒(méi)有液體 然后我用pumpwash 然后想重新上樣蛋白 發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)依然沒(méi)有壓力 然后我就去找一個(gè)博士幫忙 博士幫忙用注射器抽了系統(tǒng)的氣體 但是他說(shuō)不確定柱子是否進(jìn)氣 我現(xiàn)在有點(diǎn)擔(dān)心柱子是否進(jìn)氣 如果進(jìn)氣，如何處理來(lái)拯救柱子？ 補(bǔ)充：系統(tǒng)排出氣體后，我沒(méi)有處理柱子，就繼續(xù)上樣了 然后蛋白純化后 發(fā)現(xiàn)樣品（豬的蛋白）出峰的位置和我以前做的別的物種（雞的蛋白）不一樣。大峰大概出在第二個(gè)和第三個(gè)梯度之間，而原來(lái)雞的蛋白的出峰位置在最后一個(gè)梯度，而最后一個(gè)梯度的時(shí)候，這次僅僅是一個(gè)小峰。 后來(lái)我把這次蛋白純化的大峰和小峰全部跑SDS-PAGE膠，發(fā)現(xiàn)全部都是目的蛋白，都有雜帶。但是大峰出的蛋白濃，雜帶明顯；小峰出的蛋白弱，雜帶不明顯。（但是有師兄說(shuō)小峰估計(jì)也有雜帶，只是因?yàn)榧兌热酰?br /> 為什么要補(bǔ)充這個(gè)，是因?yàn)橛袔熜终f(shuō)，如果蛋白跑膠后，有雜帶，說(shuō)明這個(gè)柱子柱效就不是很好了。 我不是很懂，所以全部寫出來(lái)。 希望大家多多幫忙，指出如果進(jìn)氣，柱子會(huì)怎樣？是否能從蛋白中看出來(lái)？ 另外，最重要的是如何修復(fù)柱子？ 我有個(gè)師姐說(shuō)用無(wú)水乙醇大量沖洗？ 謝謝。 |
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a381261023
實(shí)習(xí)版主
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
lstt09nk(金幣+3): 感謝參與 2011-08-29 12:13:24
左旋安菲(金幣+30): 謝謝你的建議 2011-08-31 01:41:05
左旋安菲(金幣+30): лл 2011-08-31 01:41:07
lstt09nk(金幣+3): 感謝參與 2011-08-29 12:13:24
左旋安菲(金幣+30): 謝謝你的建議 2011-08-31 01:41:05
左旋安菲(金幣+30): лл 2011-08-31 01:41:07
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試試用20%的乙醇快慢結(jié)合的沖幾次試試看吧！預(yù)裝柱進(jìn)了氣是很頭疼。你看不見。 你純化之后的蛋白不純，試一下把柱子活化下看看。建議你把上樣時(shí)的流速調(diào)慢點(diǎn)。 pumpwash在換溶液的時(shí)候用到，目的是除去這個(gè)過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。氣泡進(jìn)了柱子上面的管路pumpwash是除不去。 |
2樓2011-08-29 10:52:02
冼亮淀粉酶
無(wú)蟲
生物大分子降解酶
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金幣+8, BioEPI+1): 感謝交流 2011-08-29 17:05:27
左旋安菲(金幣+90): 謝謝 我的鎳柱是預(yù)裝柱 好像不透明 我們用的fplc是GE公司的，好像也是AKTK的。不過(guò)我后來(lái)已經(jīng)把這個(gè)柱子繼續(xù)上樣 純化蛋白了 我回頭再看一下吧 2011-08-31 01:51:03
lstt09nk(金幣+8, BioEPI+1): 感謝交流 2011-08-29 17:05:27
左旋安菲(金幣+90): 謝謝 我的鎳柱是預(yù)裝柱 好像不透明 我們用的fplc是GE公司的，好像也是AKTK的。不過(guò)我后來(lái)已經(jīng)把這個(gè)柱子繼續(xù)上樣 純化蛋白了 我回頭再看一下吧 2011-08-31 01:51:03
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鎳柱是親和層析，6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，但是也不一定都沒(méi)有雜帶的，多多少少都會(huì)有，一步就到95%純度極其艱難，這跟柱效關(guān)系不大。如果覺(jué)得不夠純，就用第一次純化之后的蛋白質(zhì)作為樣品進(jìn)行第二次純化，會(huì)比第一次純化之后更純一些，但純度能達(dá)到什么程度也是運(yùn)氣問(wèn)題。 你的鎳柱是預(yù)裝柱？裝填料的容器不是透明的？如果是透明的，填料進(jìn)了氣泡之后，填料之間的空隙會(huì)比沒(méi)有空隙的地方白，一眼就看出來(lái)了。 因?yàn)槟闶窃谏蠘悠返臅r(shí)候進(jìn)空氣，所以你應(yīng)該用上樣緩沖液來(lái)沖洗，最好別用20%乙醇，因?yàn)閷游鲋娜軇└鼡Q有個(gè)原則，就是要確保溶劑之間不要起反應(yīng)，所以進(jìn)空氣的時(shí)候溶劑能不換就最好不換，因?yàn)闃悠匪幍钠鹗家汉?0%乙醇是不同的。你用起始液沖洗10個(gè)柱床體積之后，空氣應(yīng)該就差不多跑掉了，可以正常洗脫了。 我用AKTA如果進(jìn)了空氣很容易處理，因?yàn)楣艿蓝际峭该鞯�，不知道FPLC的管道是不是透明的。FPLC說(shuō)是流速更大，更耐壓，其實(shí)層析的時(shí)候流速太大對(duì)蛋白質(zhì)分離是極其不利的。 我用AKTA得出的結(jié)論，你權(quán)衡一下，合適就用，不合適就別用。 |
3樓2011-08-29 16:23:41
4樓2017-10-26 21:54:34
星易冷
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5樓2018-07-31 18:31:14
星易冷
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6樓2018-07-31 18:35:21
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