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w_goodluck銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌-枯草芽胞桿菌 total RNA提取-問(wèn)題求助 已有1人參與
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大家好，先說(shuō)下我是RNA方面新手，接觸時(shí)間不長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)室中遇到了問(wèn)題，請(qǐng)求大家?guī)椭?br />
先簡(jiǎn)單說(shuō)下實(shí)驗(yàn)方案：研究對(duì)象是枯草芽胞桿菌，培養(yǎng)條件是41度，LB+20g/L葡萄糖，240rpm，當(dāng)OD=0.9-1.1之間時(shí)，采用invitrogen TRIzol Max Bacterial RNA Isolation Kit（附件為使用說(shuō)明書(shū)）來(lái)提取4株不同基因型的枯草芽胞桿菌的total RNA，菌液量為1ml或1.5ml。total RNA是準(zhǔn)備用來(lái)進(jìn)行RNA-SEQ測(cè)序(illumia Hiseq2000平臺(tái)），做基因差異表達(dá)分析的。 問(wèn)1：該試劑盒其實(shí)只包括兩種試劑，一種為Max Bacterial Enhancement Reagent，另一種為 TRlzol@ Reagent。該試劑盒有人用過(guò)么？第一種試劑Max Bacterial Enhancement Reagent除了破壁之外還有什么作用么？比如可以固定RNA防止被降解？ 問(wèn)2：經(jīng)過(guò)幾次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Max Bacterial Enhancement Reagent試劑是失效的。這是因?yàn)橛肕ax Bacterial Enhancement Reagent提取沒(méi)有提取到RNA。但是采用100微升 TE(pH8.0)溶解的3 mg/ml溶菌酶，37度，處理8分鐘后，提取到了RNA。說(shuō)明trizol是可用的。但是帶來(lái)一個(gè)擔(dān)心：在溶菌酶處理過(guò)程中，RNA有沒(méi)有可能發(fā)生部分降解？（畢竟沒(méi)有RNA保護(hù)劑之類(lèi)存在）對(duì)于獲得的total RNA用來(lái)RNA-SEQ時(shí)，是不是會(huì)丟失一些低豐度的信息？另外一個(gè)困擾：采用溶菌酶處理后，電泳為三條條帶，BD2000測(cè)定RNA質(zhì)量尚可（260/280=2左右），但是濃度好低，1ml菌液僅提取了大概200 ng/ul的濃度(用40ul Rnase-free ddw溶解)，有人可以給出可能的原因么？是細(xì)胞破壁不完全么（實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有顯微鏡，沒(méi)法鏡檢溶菌效果）？ 問(wèn)3：該試劑盒提到每ml trizol對(duì)應(yīng)的菌的數(shù)量不超過(guò)10的8次方，請(qǐng)問(wèn)有人知道枯草芽胞桿菌在LB培養(yǎng)基下，OD為1時(shí)大概是多少菌的數(shù)量么？ 謝謝大家！ |
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2013-12-23 16:56:49, 174.61 K
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w_goodluck
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普通的步驟下trizol不能很好的裂解細(xì)胞？ 但是我看到trizol的使用說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)到單獨(dú)的使用trizol即可以應(yīng)用處理于許多材料，比如人類(lèi)、動(dòng)物、植物或細(xì)菌來(lái)源的組織（50-100毫克）和細(xì)胞（5×106），以及大量的組織（≥1g）和細(xì)胞（>107）。我有個(gè)疑問(wèn)，按照說(shuō)明書(shū)推薦用量的trizol，能保證裂解所有的細(xì)胞么？還是說(shuō)咱們提取的total RNA，只是從一部分裂解的細(xì)胞中得到的？ |
4樓2013-12-24 11:05:29
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2樓2013-12-23 17:52:53
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【答案】應(yīng)助回帖
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1. 沒(méi)用過(guò)你說(shuō)的這個(gè)kit。TRIZOL的作用是裂解細(xì)胞的。Max Bacterial Enhancement Reagent很可能是核酸酶抑制劑，用于失活核酸酶，防止RNA降解的。你用了Max Bacterial Enhancement Reagent提不到RNA應(yīng)該是細(xì)胞本身比較難破，普通的步驟下trizol不能很好的裂解細(xì)胞，也就是為什么你用溶菌酶處理后得到RNA的原因。你可以試試加TRIZOL后用65°C處理5-10min來(lái)代替室溫。 2. 用溶菌酶處理時(shí)當(dāng)然可能造成RNA的降解。加TRIZOL后因?yàn)轶w系里有酚，可以一定程度上避免RNA降解。一般RNA量少的原因都是破碎不完全。 3. TRIZOL試劑是有這個(gè)說(shuō)明，不過(guò)你可以適當(dāng)增加一點(diǎn)（10倍以?xún)?nèi)）。沒(méi)有做過(guò)枯草芽胞桿菌，不清楚OD與細(xì)胞數(shù)對(duì)應(yīng)的關(guān)系。 |
3樓2013-12-24 09:13:55
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5樓2013-12-25 07:24:05
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