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梧桐柒夕

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[求助] 質(zhì)粒PCR產(chǎn)物片段大小問題已有3人參與

質(zhì)粒為pUC57的大腸桿菌，質(zhì)粒提取用的是自制試劑盒，經(jīng)電泳過后確定是pUC57，然后用的是50μl的Taq體系進行的PCR擴增，引物自設(shè)的，將產(chǎn)物進行電泳時發(fā)現(xiàn)有兩種不同的情況。其一是得到了400+的片段（此片段為正常片段），但同時做的相關(guān)平行組還得到了6000左右的片段。有沒有相關(guān)PCR通透者可以解釋一下，這個6000左右的片段會產(chǎn)生的原因？以及這個6000的片段是否正常？

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【求助/交流】PCR產(chǎn)物雜帶很多，主帶很弱。如何進行下一步實驗？已經(jīng)有8人回復

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1樓 2014-06-08 16:37:20

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梧桐柒夕

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2樓: Originally posted by hailunl at 2014-06-08 19:11:00
有非特異性很正常，PCR不能說明問題。
例如，引物特異性不好，或者退火溫度過低，延伸時間過長都會出現(xiàn)非特異性條帶，
只要有目標條帶就可以了。
如果你想再檢測，建議提高退火溫度，質(zhì)粒為模板，退火溫度高點沒 ...

所有條件都是設(shè)計好的，已經(jīng)是最優(yōu)的了，如上述說的，部分組出現(xiàn)的是正常地，另一組出現(xiàn)的差異性很大，所以，想知道，在這個過程中，出現(xiàn)這么大片段的原因，是想知道，在怎樣的情況下會出現(xiàn)這種情況，是所有產(chǎn)物連在一起了么？

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4樓2014-06-08 21:52:47

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hailunl

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梧桐柒夕: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-06-08 21:48:47
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-07-28 16:30:18

有非特異性很正常，PCR不能說明問題。
例如，引物特異性不好，或者退火溫度過低，延伸時間過長都會出現(xiàn)非特異性條帶，
只要有目標條帶就可以了。
如果你想再檢測，建議提高退火溫度，質(zhì)粒為模板，退火溫度高點沒事；延伸時間掌控在目標條帶范圍；另外，模板稀釋10倍或50倍。

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2樓2014-06-08 19:11:00

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Neo2000

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【答案】應助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
梧桐柒夕: 金幣+5, ★有幫助 2014-06-08 21:53:33

你這個載體多大，是不是轉(zhuǎn)了一圈了？這種事常有

[ 發(fā)自小木蟲客戶端 ]

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3樓2014-06-08 19:35:27

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引用回帖:

3樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-08 19:35:27
你這個載體多大，是不是轉(zhuǎn)了一圈了？這種事常有

載體是2710bp的。

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5樓2014-06-08 21:53:23

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