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落木778

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[求助] 構(gòu)建攜帶HA標(biāo)簽的基因已有2人參與

各位，請(qǐng)求幫助，我需要在基因的3'端構(gòu)建攜帶HA標(biāo)簽，需要將終止密碼子從目的基因序列后面轉(zhuǎn)移到融合標(biāo)簽基因序列后面。
這樣做的方法是什么? 謝謝�。�！

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1樓 2015-01-23 17:08:38

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hanxiaominhu

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引用回帖:

5樓: Originally posted by 落木778 at 2015-01-23 22:43:54
你好，因?yàn)檫€沒有做過(guò)這類實(shí)驗(yàn)，實(shí)在有太多的疑問了，好希望有位大神來(lái)幫我細(xì)細(xì)解答。引物設(shè)計(jì)是不是需要與HA標(biāo)簽序列完全匹配才能擴(kuò)增出來(lái)？引物末端還需要加終止密碼子不？這樣設(shè)計(jì)是不是引物過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致Tm值過(guò)高 ...

我最多在引物的5‘端另外加了20多個(gè)堿基，引物本身長(zhǎng)20多，最后引物就有近50bp，是能P出來(lái)的，HA標(biāo)簽30多的話，可以試一試。另外Tm值的計(jì)算不是完全看引物長(zhǎng)度的，要看與模板的配對(duì)程度。

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6樓2015-01-25 09:40:16

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hanxiaominhu

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【答案】應(yīng)助回帖

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落木778(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-01-23 21:50:25

一般如果是HA標(biāo)簽在3‘端的質(zhì)粒的話，它后面會(huì)自帶終止密碼子的不用另外加，在擴(kuò)增自己基因的是候引物不帶終止密碼子就可以了，另外注意不要移碼。

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2樓2015-01-23 18:21:31

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2樓: Originally posted by hanxiaominhu at 2015-01-23 18:21:31
一般如果是HA標(biāo)簽在3‘端的質(zhì)粒的話，它后面會(huì)自帶終止密碼子的不用另外加，在擴(kuò)增自己基因的是候引物不帶終止密碼子就可以了，另外注意不要移碼。

我打算設(shè)計(jì)攜帶HA-tag的引物，然后直接PCR擴(kuò)增出目的基因-HA片段，這樣的話就涉及終止密碼子的問題了。謝謝�。�！

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3樓2015-01-23 21:26:02

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4樓2015-01-23 21:31:05

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