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shengnan1987鐵蟲 (初入文壇)
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帶HIS標(biāo)簽的可溶蛋白的純化問題
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我做的是一種蛋白酶的原核表達(dá)，c端帶一個(gè)his標(biāo)簽，大小31kd，等電點(diǎn)10，pet24a可溶表達(dá)，但表達(dá)量不高，不到50%，用鎳柱純化，Binding: 20 mM sodium phosphate, 20 mM Imidazole,500 mM NaCl, PH 8.0 Elution: 20 mM sodium phosphate, 500 mM Imidazole, 500 mM NaCl, PH8.0 調(diào)整咪唑的濃度，要么峰型好，但雜帶還是很多；要么沒有特異的峰出現(xiàn)。請問各位高手有沒有好的純化方法？非常感謝 |
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我有個(gè)疑問，你為什么不同時(shí)使用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉做的緩沖體系呢？ 給你點(diǎn)建議，參考下。 你可以試試Tris。NaCl的濃度可以提高到 1 M。而且你可以再將緩沖液pH降到7.0，同時(shí)你養(yǎng)的菌可以將誘導(dǎo)溫度還有IPTG都降低，這樣很大一部分會避免標(biāo)簽被包裹起來。 針對你說的洗脫的問題，我覺得只要有蛋白，那都不是問題了，你不能指望過個(gè)his柱就一勞永逸的能將你的蛋白很好的分開。如果需要，你后續(xù)還是要過S柱或者分子篩的。 要是你不著急的話，建議你先少量蛋白用Imidazole拉個(gè)線性試試，確定能洗下雜蛋白的最佳咪唑濃度。再用階梯去洗。 等你用階梯洗的時(shí)候，可以在目的蛋白能被洗脫的濃度之前用咪唑大量洗雜，等基線走平再去階梯洗，分主峰和拖尾峰分別收集，然后再提高咪唑濃度，依上面方法逐步洗脫。跑膠后取舍，再做下一步純化。 總之，如果線性效果不明顯，你可以拿一批直接去摸條件。什么75mM，100mM，150mM，200mM都去試試。 祝你好運(yùn)啊。 |
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