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shengnan1987鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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帶HIS標(biāo)簽的可溶蛋白的純化問(wèn)題
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我做的是一種蛋白酶的原核表達(dá)，c端帶一個(gè)his標(biāo)簽，大小31kd，等電點(diǎn)10，pet24a可溶表達(dá)，但表達(dá)量不高，不到50%，用鎳柱純化，Binding: 20 mM sodium phosphate, 20 mM Imidazole,500 mM NaCl, PH 8.0 Elution: 20 mM sodium phosphate, 500 mM Imidazole, 500 mM NaCl, PH8.0 調(diào)整咪唑的濃度，要么峰型好，但雜帶還是很多；要么沒(méi)有特異的峰出現(xiàn)。請(qǐng)問(wèn)各位高手有沒(méi)有好的純化方法？非常感謝 |
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我有個(gè)疑問(wèn)，你為什么不同時(shí)使用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉做的緩沖體系呢？ 給你點(diǎn)建議，參考下。 你可以試試Tris。NaCl的濃度可以提高到 1 M。而且你可以再將緩沖液pH降到7.0，同時(shí)你養(yǎng)的菌可以將誘導(dǎo)溫度還有IPTG都降低，這樣很大一部分會(huì)避免標(biāo)簽被包裹起來(lái)。 針對(duì)你說(shuō)的洗脫的問(wèn)題，我覺(jué)得只要有蛋白，那都不是問(wèn)題了，你不能指望過(guò)個(gè)his柱就一勞永逸的能將你的蛋白很好的分開(kāi)。如果需要，你后續(xù)還是要過(guò)S柱或者分子篩的。 要是你不著急的話，建議你先少量蛋白用Imidazole拉個(gè)線性試試，確定能洗下雜蛋白的最佳咪唑濃度。再用階梯去洗。 等你用階梯洗的時(shí)候，可以在目的蛋白能被洗脫的濃度之前用咪唑大量洗雜，等基線走平再去階梯洗，分主峰和拖尾峰分別收集，然后再提高咪唑濃度，依上面方法逐步洗脫。跑膠后取舍，再做下一步純化。 總之，如果線性效果不明顯，你可以拿一批直接去摸條件。什么75mM，100mM，150mM，200mM都去試試。 祝你好運(yùn)啊。 |
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shengnan198711樓2012-05-29 15:08:33
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表達(dá)量不高，和純化有一定的關(guān)系，但主要還是看你的菌株表達(dá)問(wèn)題，你的蛋白在包涵體內(nèi)多嗎？如果不多，那就排除這個(gè)問(wèn)題。 你可以在洗脫之前多加幾個(gè)梯度去洗雜帶， 我以前是手動(dòng)純化的，所以對(duì)你說(shuō)的峰之類(lèi)的可能不是很了解，但我做HPLC，應(yīng)該也明白，如果濃度不高，在同一個(gè)菌株的情況下，你可以選擇濃縮，用濃縮管就可以，很方便 |
8樓2012-05-28 14:49:17
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