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dshlove

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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【答案】應(yīng)助回帖

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小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵(lì)熱心應(yīng)助，謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2012-05-29 16:07:57

我有個(gè)疑問(wèn)，你為什么不同時(shí)使用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉做的緩沖體系呢？
給你點(diǎn)建議，參考下。
你可以試試Tris。NaCl的濃度可以提高到 1 M。而且你可以再將緩沖液pH降到7.0，同時(shí)你養(yǎng)的菌可以將誘導(dǎo)溫度還有IPTG都降低，這樣很大一部分會(huì)避免標(biāo)簽被包裹起來(lái)。
針對(duì)你說(shuō)的洗脫的問(wèn)題，我覺(jué)得只要有蛋白，那都不是問(wèn)題了，你不能指望過(guò)個(gè)his柱就一勞永逸的能將你的蛋白很好的分開(kāi)。如果需要，你后續(xù)還是要過(guò)S柱或者分子篩的。
要是你不著急的話，建議你先少量蛋白用Imidazole拉個(gè)線性試試，確定能洗下雜蛋白的最佳咪唑濃度。再用階梯去洗。
等你用階梯洗的時(shí)候，可以在目的蛋白能被洗脫的濃度之前用咪唑大量洗雜，等基線走平再去階梯洗，分主峰和拖尾峰分別收集，然后再提高咪唑濃度，依上面方法逐步洗脫。跑膠后取舍，再做下一步純化。
總之，如果線性效果不明顯，你可以拿一批直接去摸條件。什么75mM，100mM，150mM，200mM都去試試。
祝你好運(yùn)啊。

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shengnan1987

11樓2012-05-29 15:08:33

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引用回帖:

11樓: Originally posted by dshlove at 2012-05-29 15:08:33
我有個(gè)疑問(wèn)，你為什么不同時(shí)使用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉做的緩沖體系呢？
給你點(diǎn)建議，參考下。
你可以試試Tris。NaCl的濃度可以提高到 1 M。而且你可以再將緩沖液pH降到7.0，同時(shí)你養(yǎng)的菌可以將誘導(dǎo)溫度還有IPTG ...

謝謝，我會(huì)考慮您的方法！使用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉有什么好處呢？我是根據(jù)文獻(xiàn)和別人的經(jīng)驗(yàn)選的體系，誘導(dǎo)溫度還有IPTG都降低，表達(dá)量會(huì)更低，我最近一直在想辦法增加表達(dá)量，但是條件一高，就表達(dá)的是包涵體，我想盡可能按可溶的做。我的蛋白pi在10，ph調(diào)到7.0是不是太少了？現(xiàn)在只能盡可能篩選純化條件，請(qǐng)問(wèn)如果標(biāo)簽包裹起來(lái)，重生cuso4柱子會(huì)不會(huì)效果好點(diǎn)？洗雜和洗脫時(shí)咪唑線性范圍多少適宜啊

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12樓2012-06-27 22:57:25

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4樓: Originally posted by anzaigtt at 2012-05-28 07:56:14
如果是“表達(dá)量”不高，那是培養(yǎng)體系的問(wèn)題。和純化關(guān)系不大。

表達(dá)量我已經(jīng)摸索了iptg誘導(dǎo)劑量，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，轉(zhuǎn)速等，最后也只能按照現(xiàn)有表達(dá)量做，現(xiàn)在就希望它能純化出來(lái)

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13樓2012-06-27 23:00:10

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5樓: Originally posted by sayaya at 2012-05-28 08:06:39
要么峰型好，但雜帶還是很多；要么沒(méi)有特異的峰出現(xiàn)-----

說(shuō)明掛柱效果不好。要么是柱（樹(shù)脂）的問(wèn)題，要么是蛋白的問(wèn)題（如蛋白結(jié)構(gòu)中His-tag內(nèi)包）。
可以考慮增加樹(shù)脂量或更換樹(shù)脂或活化柱子，進(jìn)行蛋白變復(fù)性 ...

我們使用的是GE的his預(yù)裝柱，之前別人是能正常使用的，怎么增加樹(shù)脂量或更換樹(shù)脂或活化柱子？我不想對(duì)蛋白變復(fù)性，它是新分子，對(duì)后面活性和功能研究說(shuō)不清吧！還需要對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定

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14樓2012-06-27 23:03:50

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6樓: Originally posted by kedaxiaoyu at 2012-05-28 10:20:57
走過(guò)梯度沒(méi)？沒(méi)有的話可以走個(gè)咪唑的洗脫梯度試試。

恩

15樓2012-06-27 23:04:00

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8樓: Originally posted by jasonwyb123 at 2012-05-28 14:49:17
表達(dá)量不高，和純化有一定的關(guān)系，但主要還是看你的菌株表達(dá)問(wèn)題，你的蛋白在包涵體內(nèi)多嗎？如果不多，那就排除這個(gè)問(wèn)題。
你可以在洗脫之前多加幾個(gè)梯度去洗雜帶，我以前是手動(dòng)純化的，所以對(duì)你說(shuō)的峰之類(lèi)的可能 ...

在現(xiàn)有條件或更低條件很少或沒(méi)有包涵體，稍微高一點(diǎn)就是包涵體了，我的蛋白是在rostta(de3)中表達(dá)的，表達(dá)比bl21少得多，有人建議我用hplc進(jìn)行精心純化，不知道可行嗎？先過(guò)離子交換柱是不是會(huì)先去掉一些雜質(zhì)？但我不知道選擇陽(yáng)離子還是陰離子交換柱？緩沖液怎么選擇呢？濃度是由我我接的細(xì)菌量決定的，所以這個(gè)不是問(wèn)題

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16樓2012-06-27 23:12:23

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9樓: Originally posted by radium4046 at 2012-05-28 15:39:16
用梯度洗啊，50-100-250-500，或者拉個(gè)20~500的線性；你用的什么鎳柱呢，是預(yù)裝的還是自己填的，是IDA還是NTA，NTA特異結(jié)合好一點(diǎn)，不過(guò)有條件的話用GE的預(yù)裝柱效果更好；峰形好的時(shí)候，你是把峰pool到一起跑的電泳 ...

恩，我下次試試梯度洗，我用的是GE的預(yù)裝柱，買(mǎi)了沒(méi)多久，之前沒(méi)用過(guò)幾次，是IDA還是NTA我回去再查查，峰型好的時(shí)候峰很尖的，沒(méi)有拖尾，收到一起大約幾百微升，沒(méi)辦法再細(xì)分了

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17樓2012-06-27 23:19:23

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12樓: Originally posted by shengnan1987 at 2012-06-27 22:57:25
謝謝，我會(huì)考慮您的方法！使用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉有什么好處呢？我是根據(jù)文獻(xiàn)和別人的經(jīng)驗(yàn)選的體系，誘導(dǎo)溫度還有IPTG都降低，表達(dá)量會(huì)更低，我最近一直在想辦法增加表達(dá)量，但是條件一高，就表達(dá)的是包涵體， ...

磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉緩沖體系，首先，磷酸基團(tuán)是陰離子基團(tuán)，你的蛋白PI是10，緩沖液的pH要低于10 ，便于上S柱，這個(gè)緩沖液就很理想了。還有，就是它的緩沖范圍和TRIS是不同的。Tris不行就能試試這個(gè)緩沖液了。
其實(shí)有時(shí)候表達(dá)量低但是蛋白可溶和表達(dá)量高形成包涵體，我想，怎么選擇，你是很清楚的。怕的是表達(dá)量低還他娘形成包涵體！
你說(shuō)的pH沒(méi)必要到7.0，到7.5就差不多了，還有就是，每個(gè)蛋白都有合適pH，選擇不當(dāng)雖然初期純化沒(méi)什么問(wèn)題，到后期純化，蛋白濃度一高，濃縮什么的，就會(huì)沉淀，很坑的！
Cu的柱子，我沒(méi)用過(guò)，我用的一直是Ni的，其實(shí)原理差不多，沒(méi)什么實(shí)質(zhì)性差異，標(biāo)簽包裹起來(lái)，還想親和純化的話就要變復(fù)性了，這個(gè)考慮的就多了。至于你說(shuō)的咪唑范圍，我前面說(shuō)的，你去試，每個(gè)蛋白不同，就算同種蛋白，每個(gè)批次也是不太一樣的，所以我不能給你確切的范圍，建議是上完樣后，先用破細(xì)胞BUFFER大量沖洗，一根柱子要100Ml，再用10mM咪唑，20mM咪唑，分別沖洗2-3個(gè)柱體積，最后用300mM洗脫下來(lái)。
記得及時(shí)平衡柱子哦。

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18樓2012-06-29 14:18:41

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18樓: Originally posted by dshlove at 2012-06-29 14:18:41
磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉緩沖體系，首先，磷酸基團(tuán)是陰離子基團(tuán)，你的蛋白PI是10，緩沖液的pH要低于10 ，便于上S柱，這個(gè)緩沖液就很理想了。還有，就是它的緩沖范圍和TRIS是不同的。Tris不行就能試試這個(gè)緩沖液了。 ...

恩我會(huì)都試試的，謝謝你！有問(wèn)題我再請(qǐng)教

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19樓2012-06-29 22:33:13

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edoz1986

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用20mm imi的上樣，最好中間加一個(gè)50mm的imi繼續(xù)洗雜。再一個(gè)可能就是你的蛋白降解了，那么帶his標(biāo)簽的降解帶也會(huì)掛柱子，建議用wb檢測(cè)一下是否降解帶。

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20樓2013-05-23 09:35:06

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