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tjutrevor金蟲 (正式寫手)
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[求助]
蛋白純化分離問題
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目前在做酶的分離純化，報道的僅有4個相同功能的酶，但是比對后基本沒有保守序列。。。 我做的菌也沒有全基因組序列。。。 是不是只能一步一步純化，直到SDS一條帶？ 實驗時先過陰離子交換，后過分子篩，但是效果也不好。SDS的雜帶較多，但是有一條帶貌似是要找的。不知切膠做N端測序可不可以？引物如何設(shè)計呢？ 還望請大牛們指點。謝謝了 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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silicare(金幣+5, EPI+1): good 2011-06-03 18:16:54
tjutrevor(金幣+20): 多謝！我是先硫氨沉淀的，不過沒有脫鹽 2011-06-05 14:38:30
silicare(金幣+5, EPI+1): good 2011-06-03 18:16:54
tjutrevor(金幣+20): 多謝！我是先硫氨沉淀的，不過沒有脫鹽 2011-06-05 14:38:30
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1、 你的菌既然沒有全基因測序，那么就不能設(shè)計引物來直接克隆。 2、 如果報道的僅有4個相同功能的酶，但是比對后基本沒有保守序列，那就是說你的酶純化出來之后可能會容易發(fā)文章。 3、 蛋白質(zhì)純化是需要一步一步來的，野生酶只要一步就能純化就很夸張。 4、 為什么要先用離子交換層析柱？無論什么方法來培養(yǎng)的微生物，得到的酶，都會有很多雜質(zhì)，包括細胞碎片和培養(yǎng)基成分等等，還有一些鹽，這樣的酶液要用離子交換層析柱就必須先去鹽，而且有一些雜質(zhì)還不一定能用0.22微米的濾膜過濾去掉，所以我認為第一步可以先用某種方法來初步純化，例如硫酸銨沉淀和小分子有機溶劑沉淀，這樣能去掉很多雜質(zhì)，包括一些蛋白質(zhì)雜質(zhì)。假如是硫酸銨沉淀，那就可以立即用疏水層析柱，假如是有機溶劑沉淀，那么下一步可以去掉小分子有機溶劑，反正也要脫鹽的，鹽和小分子有機溶劑都可以被除掉。這樣一來就更好了。 5、 凝膠過濾的效率是比較差的，不到不得已就別用，而且要求上樣的樣品體積要小，在縮小體積這一步說不定會損失蛋白質(zhì)，說不定你的酶也有損失。 6、 既然條帶很多，那就說明你要的那條帶說不定也不純，打質(zhì)譜都可能打不出來，測序也一樣可能測不出來，還是先純一點再考慮切膠保險。 |
4樓2011-06-03 01:12:15
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
silicare(金幣+3): 鼓勵交流 2011-06-03 18:18:13
silicare(金幣+3): 鼓勵交流 2011-06-03 18:18:13
| 談下俺的建議。。我感覺首先應(yīng)該先按照分子量先過一個分子篩。。粗分下符合分子量范圍的蛋白。。然后再過陰離子（當然是根據(jù)您蛋白的性質(zhì)）進行細分。。如果離子交換分的還不干凈的話。。來個強陰離子交換。。先陰離子的話我感覺。。畢竟載量有限。。雜蛋白很多。�？赡苣愕哪康牡鞍捉Y(jié)合效果不會太好。。會有較多浪費。。不如先分子篩再離子交換。。至于測序的問題。。N端的蛋白測序好像不用設(shè)計引物捏。。質(zhì)譜好像就行。。當然N端的10個之內(nèi)好像挺準（價錢好像也不貴捏）。。太多恐怕就信號不太強了。。。不知道你這個左右的氨基酸能否作為鑒別標準。。 |
5樓2011-06-03 11:37:28
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3樓2011-06-02 19:23:19
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silicare(金幣+3): 鼓勵交流 2011-06-03 18:18:05
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我不建議第一步就是分子篩，理由是 1、分子量還不知道是多少，因為已經(jīng)報道的基因沒有同源性，不能依靠這個來估計自己的酶的同源性。當然如果能測定酶活力的話也不存在這個問題。 2、粗酶液里雜質(zhì)較多，如果一下子把體積濃縮到很小，那么雜質(zhì)會沉淀，會帶動一部分酶也共沉淀，造成損失。 3、如果用離子交換層析，即使蛋白質(zhì)太多，超出載量，那也是在穿透液中，可以再次過柱，蛋白質(zhì)不會有任何損失。 4、N端的蛋白測序確實不用設(shè)計引物。 5、質(zhì)譜和測序的問題，我是不建議立即做的，理由就是單條帶也可能不純，因為蛋白質(zhì)太多，所以存在兩個蛋白質(zhì)跑到一起的隱患。 6、離子交換層析不只是陰離子交換，還有陽離子交換層析的，這就看蛋白質(zhì)的等電點了。 樓上的猴子路飛怎么把草帽換了，那是夢想，不能換。 |
6樓2011-06-03 15:56:19
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