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njunkai新蟲 (初入文壇)
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[求助]
進行羥胺裂解后，進行蛋白的二次過親和層析住純化問題�。。。∏笾� �。。�
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做融合蛋白的分離純化，第一次純化以1ml破菌后的融合蛋白溶液：0.4ml的親和層析樹脂進行純化去除雜蛋白，基本可以洗脫完全雜蛋白，這親和樹脂的量是足夠的。然后將洗脫的融合蛋白進行透析復(fù)性，冷凍干燥。 通過其羥胺裂解位點來裂解開目的蛋白和載體蛋白。。。羥胺裂解由于效率不高，故其還有剩余的融合蛋白，所以裂解后電泳的條帶就有三條了：未裂解的融合蛋白、載體蛋白和目的蛋白�，F(xiàn)在進行二次過親和層析柱，因為參照前面第一次純化，羥胺裂解，理應(yīng)這羥胺裂解蛋白濃度是比第一次純化時蛋白要低的，可按照這個裂解后的溶液按照1ml裂解液：0.4ml親和層析樹脂進行二次純化，可洗脫下來的就是不單單只有目的蛋白啊 ！�。∵@怎么回事呢？麻煩各位懂的大蝦們幫小弟解答下�。�！謝謝啊�。�！ |
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njunkai
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adslye(金幣+3): 感謝交流~~請繼續(xù)深入討論吧~~ 2011-08-29 09:57:53
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http://www.www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3469491 你的純化思路和這篇帖子里提的文獻有點像。 正如3樓所說，有標簽的就能結(jié)合，所以如果親和柱效率足夠高，從穿透峰里能夠得到比較純的目的蛋白。 |
5樓2011-08-29 08:22:24
njunkai
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如果是我做這個實驗的話。 我設(shè)計的融合蛋白是“目的蛋白-羥胺位點-Histag” 有兩種方案： （1）第一次親和純化后從柱子上獲得純化的“目的蛋白-羥胺位點-Histag” 通過羥胺切割，獲得目的蛋白、Histag、以及沒有切割的“目的蛋白-羥胺位點-Histag” 第二次親和純化，利用Ni或Co柱特異性結(jié)合掉Histag和沒有切割的“目的蛋白-羥胺位點-Histag”，從穿透峰里獲得純化的目的蛋白——風(fēng)險是還是可能會有沒有結(jié)合的雜蛋白。 （2）過親和柱子，不洗脫，而是直接在柱子上原位進行羥胺裂解——我沒做過羥胺裂解，所以不知道是否會影響結(jié)合，你可以查下相關(guān)文獻 第一次洗脫，得到切下來的目的蛋白 第二次洗脫，得到?jīng)]有切割的沒有切割的“目的蛋白-羥胺位點-Histag”以及Histag。 這樣只需要過一次親和柱，不知道我理解的是不是對不對？ |
7樓2011-08-29 14:32:28
njunkai
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8樓2011-08-29 16:28:35
danbomingyue
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9樓2012-06-07 17:15:54
danbomingyue
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