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njunkai新蟲 (初入文壇)
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[求助]
進(jìn)行羥胺裂解后，進(jìn)行蛋白的二次過親和層析住純化問題�。。�！求助啊 ！��！
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做融合蛋白的分離純化，第一次純化以1ml破菌后的融合蛋白溶液：0.4ml的親和層析樹脂進(jìn)行純化去除雜蛋白，基本可以洗脫完全雜蛋白，這親和樹脂的量是足夠的。然后將洗脫的融合蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，冷凍干燥。 通過其羥胺裂解位點(diǎn)來裂解開目的蛋白和載體蛋白。。。羥胺裂解由于效率不高，故其還有剩余的融合蛋白，所以裂解后電泳的條帶就有三條了：未裂解的融合蛋白、載體蛋白和目的蛋白�，F(xiàn)在進(jìn)行二次過親和層析柱，因?yàn)閰⒄涨懊娴谝淮渭兓�，羥胺裂解，理應(yīng)這羥胺裂解蛋白濃度是比第一次純化時蛋白要低的，可按照這個裂解后的溶液按照1ml裂解液：0.4ml親和層析樹脂進(jìn)行二次純化，可洗脫下來的就是不單單只有目的蛋白啊 �。。∵@怎么回事呢？麻煩各位懂的大蝦們幫小弟解答下！��！謝謝�。。。� |
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imfly77
木蟲 (小有名氣)
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如果是我做這個實(shí)驗(yàn)的話。 我設(shè)計的融合蛋白是“目的蛋白-羥胺位點(diǎn)-Histag” 有兩種方案： （1）第一次親和純化后從柱子上獲得純化的“目的蛋白-羥胺位點(diǎn)-Histag” 通過羥胺切割，獲得目的蛋白、Histag、以及沒有切割的“目的蛋白-羥胺位點(diǎn)-Histag” 第二次親和純化，利用Ni或Co柱特異性結(jié)合掉Histag和沒有切割的“目的蛋白-羥胺位點(diǎn)-Histag”，從穿透峰里獲得純化的目的蛋白——風(fēng)險是還是可能會有沒有結(jié)合的雜蛋白。 （2）過親和柱子，不洗脫，而是直接在柱子上原位進(jìn)行羥胺裂解——我沒做過羥胺裂解，所以不知道是否會影響結(jié)合，你可以查下相關(guān)文獻(xiàn) 第一次洗脫，得到切下來的目的蛋白 第二次洗脫，得到?jīng)]有切割的沒有切割的“目的蛋白-羥胺位點(diǎn)-Histag”以及Histag。 這樣只需要過一次親和柱，不知道我理解的是不是對不對？ |
7樓2011-08-29 14:32:28
njunkai
新蟲 (初入文壇)
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3樓2011-08-28 15:57:31
4樓2011-08-28 19:15:02
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