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njunkai新蟲 (初入文壇)
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[求助]
進(jìn)行羥胺裂解后，進(jìn)行蛋白的二次過(guò)親和層析住純化問(wèn)題�。。�！求助啊 �。�！
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做融合蛋白的分離純化，第一次純化以1ml破菌后的融合蛋白溶液：0.4ml的親和層析樹脂進(jìn)行純化去除雜蛋白，基本可以洗脫完全雜蛋白，這親和樹脂的量是足夠的。然后將洗脫的融合蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，冷凍干燥。 通過(guò)其羥胺裂解位點(diǎn)來(lái)裂解開(kāi)目的蛋白和載體蛋白。。。羥胺裂解由于效率不高，故其還有剩余的融合蛋白，所以裂解后電泳的條帶就有三條了：未裂解的融合蛋白、載體蛋白和目的蛋白。現(xiàn)在進(jìn)行二次過(guò)親和層析柱，因?yàn)閰⒄涨懊娴谝淮渭兓�，羥胺裂解，理應(yīng)這羥胺裂解蛋白濃度是比第一次純化時(shí)蛋白要低的，可按照這個(gè)裂解后的溶液按照1ml裂解液：0.4ml親和層析樹脂進(jìn)行二次純化，可洗脫下來(lái)的就是不單單只有目的蛋白啊 �。�！這怎么回事呢？麻煩各位懂的大蝦們幫小弟解答下�。�！謝謝啊�。�！ |
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3樓2011-08-28 15:57:31
njunkai
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2樓2011-08-28 11:14:28
【答案】應(yīng)助回帖
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不是很了解融合蛋白的純化。 不知你那親和膠是什么膠，配體是什么。也不知道你二次純化后雜蛋白是多還是微量。 有沒(méi)有這種可能：沒(méi)有裂解的融合蛋白和目的蛋白一起掛柱再被洗脫，造成你的二次純化不純。 還有你用的膠蛋白配體會(huì)不會(huì)有脫落。有時(shí)親和膠用太久了或膠本身就不好的話，會(huì)有配體脫落的現(xiàn)象。若配體是蛋白且有脫落，肯定不純了。不過(guò)這種情況應(yīng)該是痕量的，第一種可能性大些。 |
4樓2011-08-28 19:15:02
imfly77
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adslye(金幣+3): 感謝交流~~請(qǐng)繼續(xù)深入討論吧~~ 2011-08-29 09:57:53
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http://www.www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3469491 你的純化思路和這篇帖子里提的文獻(xiàn)有點(diǎn)像。 正如3樓所說(shuō)，有標(biāo)簽的就能結(jié)合，所以如果親和柱效率足夠高，從穿透峰里能夠得到比較純的目的蛋白。 |
5樓2011-08-29 08:22:24
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