質(zhì)粒PCR產(chǎn)物片段大小問題
質(zhì)粒為pUC57的大腸桿菌，質(zhì)粒提取用的是自制試劑盒，經(jīng)電泳過后確定是pUC57，然后用的是50μl的Taq體系進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，引物自設(shè)的，將產(chǎn)物進(jìn)行電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)有兩種不同的情況。其一是得到了400+的片段（此片段為正常片段），但同時(shí)做的相關(guān)平行組還得到了6000左右的片段。有沒有相關(guān)PCR通透者可以解釋一下，這個(gè)6000左右的片段會(huì)產(chǎn)生的原因？以及這個(gè)6000的片段是否正常？
返回小木蟲查看更多
今日熱帖
京公網(wǎng)安備 11010802022153號(hào)
被污染的情況應(yīng)該也可以排除，使用的是同一管混合液。
好的。多謝～
PCR過程中，所P的片段有可能形成聚合物么，就是產(chǎn)物片段在特殊情況下形成重復(fù)片段聚合在一起了~~~
1.不可能轉(zhuǎn)兩圈，第一圈到引物那里就停下來了。就算沒停下來也是多擴(kuò)了引物端的幾個(gè)堿基。
2.LZ你要擴(kuò)400bp的產(chǎn)物，延伸時(shí)間肯定不會(huì)超過1min的，除非用的快速高保真那種酶，從速度上說也是不可能轉(zhuǎn)圈的。
3.LZ你說你的產(chǎn)物片段聚合在一起。這個(gè)問題就復(fù)雜了。你的基因是多重復(fù)序列嗎？一般用反向PCR或者POE—PCR直接擴(kuò)載體的時(shí)候條件不太好會(huì)出現(xiàn)多聚物聚集在點(diǎn)樣孔跑不出來的現(xiàn)象。至于一般的從載體上擴(kuò)基因會(huì)有雜帶，但是這種復(fù)雜多聚物的情況至少我沒遇見過啊。
4.你的體系里除了載體就是擴(kuò)出來的片段，如果你想探查原因的話，回收6000的片段做個(gè)雙酶切算了。如果切出來載體帶了，那說明這6000至少還是載體參與形成的。如果有基因的帶了那真有可能像你說的多聚物。
首先，關(guān)于前三個(gè)的，第一條有人指出是不可能的了，第二條，延伸時(shí)間30s每個(gè)循環(huán)，條件都是合適的，有兩組是正常的400+bp，第三個(gè)，重復(fù)序列是一個(gè)老師提出的建議，他們也有出現(xiàn)過聚合物的情況，現(xiàn)在在做產(chǎn)物純化，想驗(yàn)證另一個(gè)想法，關(guān)于你說的雙酶切，多謝建議，我查查之后再做一下。喔，關(guān)于你說的多聚物聚集在點(diǎn)樣孔跑不出的現(xiàn)象，是沒有的，電泳采用的Marker是5000的，有兩組是400+，有三組是在5000以上的部分，很干凈的條帶，是可以跑動(dòng)的
，
1.如果考慮重復(fù)序列的話還是得關(guān)注你的基因，因?yàn)檩d體肯定是不會(huì)有那么多重復(fù)序列的。
2.這個(gè)6000的片段很影響你下面的實(shí)驗(yàn)嗎？不影響的話為什么糾結(jié)在這里呢
因?yàn)榫褪茄芯窟@個(gè)的呀~也不能說的太詳細(xì)，就是想知道我P出來的這些個(gè)400+的片段為什么會(huì)變成6000+。以為不了解，所以云里霧里的。嚶嚶。
如果找出原因，就不用再往下做了，這個(gè)是沒有后續(xù)試驗(yàn)的。
我所說的重復(fù)序列多聚物，就是指這些400+的片段在某種特定條件下形成了重復(fù)序列的多聚物，有這個(gè)可能么？
您好，問一下，您在做PCR的時(shí)候，有出現(xiàn)過P出的片段不是所需片段的時(shí)候么？