與PMD-19T連接問題
用PMD-19T載體與我的目的基因片段（3.3kb）鏈接，之前用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增后通過加A試劑盒進(jìn)行加A尾，之后熱擊轉(zhuǎn)化，涂布后長出菌落，但是提質(zhì)粒鑒定后發(fā)現(xiàn)載體自連（單雙酶切條帶一樣，只有一條，有一個(gè)不一樣的，但單切有出現(xiàn)兩條條帶）；后來用一步克隆試劑盒進(jìn)行連接，但涂布后沒有菌落，一直不知道是什么原因，請(qǐng)高人指教···
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京公網(wǎng)安備 11010802022153號(hào)
平末端的再加A進(jìn)行ta克隆，效率本來就很低，你可以考慮用taq，循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)，多擴(kuò)一點(diǎn)，回收時(shí)少加點(diǎn)水濃縮，連接時(shí)不加水多加PCR產(chǎn)物，試試，祝好
我用Ex-Taq酶做過一次，片段是P出來了，而且都說用它P的都會(huì)存在A尾，所以就直接連了，鑒定時(shí)還是沒有連上···
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我也感覺是在這一步，但是又沒法解釋最后鑒定的時(shí)候載體居然都是自連的···
建議做藍(lán)白篩選，換ligase，直觀提高連接效率