求助大神們，PCR引物C端如何加蛋白標簽flag？
急急急，求大神們救救急（。。。。。。。。。。。。。。。。湊字數(shù)。。。。。。。。。。。。。。。。。前面的帖子以及刪了，怎么這個還提示
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老師讓我在引物（PCR引物）序列中引入蛋白標簽flag，方便后續(xù)的純化。我的蛋白是分泌蛋白，我查到分泌蛋白一般建議把標簽插在C端，求問大神們，我這樣設計對不對？
上游引物F ：CCC（保護堿基）+ AAGCTT （酶切位點）+ KOZAK序列 +引物序列+GATTACAAGGATGACGACGATAAG（標簽序列）
下游引物R：GC（保護堿基）+ GTCGAC（酶切位點） +引物序列 +CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC（flag標簽序列反向互補）
我之前查的有人說說標簽蛋白只需要加在上游引物就行，下游不用加？但那樣兩個的TM值不就差距很大了嗎？
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大神，你的意思是下游引物的蛋白標簽應該在引物序列之前嗎？是這樣嗎？
上游引物F ：CG（保護堿基）+ AAGCTT （酶切位點）+ KOZAK序列 +引物序列
下游引物R：CG（保護堿基）+ GTCGAC（酶切位點） +蛋白標簽序列 +引物序列
引物設計我也用的Prime5軟件，師姐跟我說設計完把保護堿基酶切位點加上去就行。迷惑的點就是蛋白標簽位置應該加在哪里？師姐她之前也沒有這個經(jīng)驗。大神，那你這層樓的意思我沒大懂。你看可以順序可以這么來嗎？
上游引物F ：CG（保護堿基）+ AAGCTT （酶切位點）+ KOZAK序列 +引物序列
下游引物R：CG（保護堿基）+ GTCGAC（酶切位點） +蛋白標簽序列 +引物序列
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