求助做過(guò)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移的同學(xué)們呀
我用PKC1139質(zhì)粒進(jìn)行屬間接合轉(zhuǎn)移，三個(gè)多月了都沒(méi)有結(jié)合子生長(zhǎng)不知道是什么問(wèn)題呀�，F(xiàn)在在進(jìn)行條件摸索和體系建立。
就是孢子過(guò)濾洗脫后40℃，45℃，50℃，55℃這幾個(gè)條件熱激10分鐘后，28攝氏度震蕩培養(yǎng)2.4.6小時(shí)后，與生長(zhǎng)到OD600=0.4-0.5的大腸桿菌1:1混合以后涂在含有20毫摩爾氯化鎂的MS培養(yǎng)基上，放置16.18.20.22小時(shí)后涂相應(yīng)萘啶酮酸和安普霉素，抗生素濃度都是做過(guò)敏感性實(shí)驗(yàn)的應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題，但是一直沒(méi)有結(jié)合子生長(zhǎng)，是我操作有問(wèn)題還是這個(gè)質(zhì)粒在我的菌體里不實(shí)用呀做過(guò)的小伙伴幫我看一下啦
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京公網(wǎng)安備 11010802022153號(hào)
不好做
做了兩年 是很不好做呀
先用pset152這種整合型質(zhì)粒摸索條件，提高接合轉(zhuǎn)移條件，再用pkc1139這種可能才能長(zhǎng)少量接合子，直接用1139很難
我也花了大半年的時(shí)間磨出來(lái)的，說(shuō)說(shuō)我的經(jīng)驗(yàn)吧。首先是大腸桿菌的狀態(tài)，供體的狀態(tài)一定要好，不然做不出來(lái)的，一般我建議搖到0.6，用5毫升做供體。其次是受體，我之前用孢子一直做不出來(lái)，之后用菌絲體做出來(lái)了，菌絲體的接合轉(zhuǎn)移比孢子效率高，但你得提前摸好菌絲體在不同時(shí)間段對(duì)應(yīng)的OD值以及對(duì)應(yīng)菌落數(shù)，這個(gè)過(guò)程比較痛苦，因?yàn)橐煌５娜�，測(cè)生長(zhǎng)曲線，（這些得自己查文獻(xiàn)，文獻(xiàn)積累很重要），之后就是供受比，抗生素濃度，覆蓋時(shí)間等條件了。記得多看文獻(xiàn)！祝你順利
，
還有一點(diǎn)就是用來(lái)做菌絲體的培養(yǎng)基不能結(jié)球
還有就是要加氯化鈣，有文獻(xiàn)的，好多是研究接合轉(zhuǎn)移的條件優(yōu)化的，多看看，總結(jié)一下。你的痛苦我經(jīng)歷過(guò)