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舒晉Jean新蟲 (初入文壇)
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[求助]
構(gòu)建好的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，可檢測(cè)到蛋白的表達(dá)，但蛋白不發(fā)揮功能 已有1人參與
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各位大神好， 本人研三即將畢業(yè)，擔(dān)心畢業(yè)論文，現(xiàn)在我的實(shí)驗(yàn)遇到一個(gè)完全做不下去的困難，希望各位同仁幫我看看到底是哪里有問題，我第一次發(fā)帖求助，金幣只有這么多，全掏出來了，實(shí)在不好意思。 具體是這樣的，我一直在構(gòu)建Bax-pcDNA3.1V5HISC載體，做完轉(zhuǎn)化后，陽性菌液就送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果沒有問題，后面提了質(zhì)粒也送過，結(jié)果也沒問題，之后就轉(zhuǎn)到BAX-KO細(xì)胞中，可以檢測(cè)到BAX融合蛋白的表達(dá)，大約是在25KD左右，然后用G418篩選，篩了很長一段時(shí)間，還是能檢測(cè)到蛋白的表達(dá)，但是問題就來，穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系加了藥之后不會(huì)發(fā)生死亡，而按道理，這類藥在這類細(xì)胞中HCT116細(xì)胞中通過線粒體途徑凋亡（也就是依賴于BAX）,陽性對(duì)照即HCT116WT細(xì)胞死了很多，這就是說明，我構(gòu)建的BAX不發(fā)揮作用，后面我查了寫資料，資料上說BAX發(fā)揮作用要多聚化，讓線粒體膜通透性加大，我猜想是否是我構(gòu)建的蛋白由于不多聚化所以加藥之后不會(huì)凋亡，但bax的多聚化，老師說不好做，所以沒有去做。所以我就換了載體pcNDA3.1+,把標(biāo)簽FLAG放在N端，但是結(jié)果還是不如人意，急暈了，但又無從下手。 有沒有同學(xué)和我一樣的，構(gòu)建好載體，蛋白表達(dá)卻不發(fā)揮作用的，請(qǐng)問你們是如何解決的，跪求幫助！ |
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youwid
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2樓2016-03-04 13:55:25
舒晉Jean
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3樓2016-03-08 15:32:36
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