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[求助]
構建好的重組質粒，轉染進入細胞，可檢測到蛋白的表達，但蛋白不發(fā)揮功能 已有1人參與
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各位大神好， 本人研三即將畢業(yè)，擔心畢業(yè)論文，現(xiàn)在我的實驗遇到一個完全做不下去的困難，希望各位同仁幫我看看到底是哪里有問題，我第一次發(fā)帖求助，金幣只有這么多，全掏出來了，實在不好意思。 具體是這樣的，我一直在構建Bax-pcDNA3.1V5HISC載體，做完轉化后，陽性菌液就送去測序，測序結果沒有問題，后面提了質粒也送過，結果也沒問題，之后就轉到BAX-KO細胞中，可以檢測到BAX融合蛋白的表達，大約是在25KD左右，然后用G418篩選，篩了很長一段時間，還是能檢測到蛋白的表達，但是問題就來，穩(wěn)轉的細胞系加了藥之后不會發(fā)生死亡，而按道理，這類藥在這類細胞中HCT116細胞中通過線粒體途徑凋亡（也就是依賴于BAX）,陽性對照即HCT116WT細胞死了很多，這就是說明，我構建的BAX不發(fā)揮作用，后面我查了寫資料，資料上說BAX發(fā)揮作用要多聚化，讓線粒體膜通透性加大，我猜想是否是我構建的蛋白由于不多聚化所以加藥之后不會凋亡，但bax的多聚化，老師說不好做，所以沒有去做。所以我就換了載體pcNDA3.1+,把標簽FLAG放在N端，但是結果還是不如人意，急暈了，但又無從下手。 有沒有同學和我一樣的，構建好載體，蛋白表達卻不發(fā)揮作用的，請問你們是如何解決的，跪求幫助！ |
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3樓2016-03-08 15:32:36
2樓2016-03-04 13:55:25
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