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tkl0621金蟲 (小有名氣)
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[求助]
培養(yǎng)的多環(huán)芳烴細菌，最近送樣去北京檢測，pcr擴增無果 已有5人參與
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各位同仁，年前培養(yǎng)的以多環(huán)芳烴為唯一碳源的細菌，本月初將甘油保存的菌種送去檢測，那邊告知我出來的結(jié)果不理想，干擾峰較多，不易區(qū)別，測樣公司說是菌種受污染了或者沒有純化好；后面我又劃線到固體平板上，包扎牢牢地給他們寄送過去，這次又讓我吃驚地是pcr擴增不成功，工作人員說是細菌的細胞壁太厚造成失敗了，我也是外行，不太懂這方面的知識，請大家?guī)臀曳治鱿�，�?yīng)該如何做？ 1.png 2.png 3.png 4.png |
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tkl0621
12樓2016-03-22 09:17:58
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1. 從峰圖看模板應(yīng)該是純的，否則同一位置應(yīng)該有不同高度的套峰，所以我懷疑技術(shù)人員的解釋有些問題，至少你這次這個峰圖看不出有DNA交叉污染跡象。 2. 技術(shù)人員解釋說細菌壁太厚沒打開，我認為這個解釋有一定道理。從峰圖看銳利度明顯不夠，造成這個原因的因素有很多，試劑，反應(yīng)溫度，模板量都有可能。測序公司走樣都是模式化的也就是第一個啟動cycle的時間可能就是3-5分鐘左右，后面的解鏈時間更短。如果第一次細胞沒打開后面可能要到多個循環(huán)后細胞才被裂開，最后峰圖可能就跑不出來。 3.個人建議你先采用上面網(wǎng)友提到的菌落PCR建議，第一個循環(huán)95度用10-15分鐘裂細胞從而增加模板濃度。如果能擴出來基本就可以確定是模板量不夠?qū)е碌�。當然菌落PCR也有干擾問題，如果直接PCR還沒有結(jié)果建議先用95度裂細胞10-15分鐘，然后離心取上清DNA做PCR模板減少其它細胞組分干擾。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
13樓2016-03-23 04:30:53
21樓2016-06-14 11:38:42
tkl0621
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2樓2016-03-20 13:02:56
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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自己培養(yǎng)。買dna提取試劑盒提dna自己pcr，把結(jié)果送去測序�，F(xiàn)在的公司都亂來的。試劑盒可以用mp的土壤dna提取試劑盒。普通的dna提取專用試劑盒不好提 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2016-03-20 13:13:09
匿名
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4樓2016-03-20 16:01:02
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5樓2016-03-20 16:03:18
tkl0621
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工作人員告訴我說甘油保存的菌里混有雜菌，測序干擾峰很多，不易區(qū)分到底是哪個菌種。這個到底應(yīng)該如何搞定，這家生物公司是北京鼎國生物，也是我?guī)熃阃扑]給我的。希望你能幫到我，或者指引我到比較正規(guī)的公司做，多謝了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-03-20 20:42:42
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7樓2016-03-20 22:14:42
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8樓2016-03-20 22:15:32
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9樓2016-03-21 06:18:24
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10樓2016-03-21 07:23:43
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