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tkl0621金蟲 (小有名氣)
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[求助]
培養(yǎng)的多環(huán)芳烴細(xì)菌，最近送樣去北京檢測(cè)，pcr擴(kuò)增無果 已有5人參與
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各位同仁，年前培養(yǎng)的以多環(huán)芳烴為唯一碳源的細(xì)菌，本月初將甘油保存的菌種送去檢測(cè)，那邊告知我出來的結(jié)果不理想，干擾峰較多，不易區(qū)別，測(cè)樣公司說是菌種受污染了或者沒有純化好；后面我又劃線到固體平板上，包扎牢牢地給他們寄送過去，這次又讓我吃驚地是pcr擴(kuò)增不成功，工作人員說是細(xì)菌的細(xì)胞壁太厚造成失敗了，我也是外行，不太懂這方面的知識(shí)，請(qǐng)大家?guī)臀曳治鱿�，�?yīng)該如何做？ 1.png 2.png 3.png 4.png |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1 PAHs degrader在實(shí)驗(yàn)過程中的的確確經(jīng)常有雜菌 2 正確的做法是在PAHs 平板上長出來后，持續(xù)在R2A或者LB平板上分離純化3-5次，獲得的單菌落測(cè)試其降解能力，如果依然具有降解能力，就進(jìn)行保種 3 測(cè)序的時(shí)候，自己做PCR， TA克隆，然后送去持續(xù)。很多人不喜歡用TA克隆測(cè)序，而習(xí)慣用PCR，我個(gè)人認(rèn)為，這樣不好！ |
tkl0621
12樓2016-03-22 09:17:58
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1. 從峰圖看模板應(yīng)該是純的，否則同一位置應(yīng)該有不同高度的套峰，所以我懷疑技術(shù)人員的解釋有些問題，至少你這次這個(gè)峰圖看不出有DNA交叉污染跡象。 2. 技術(shù)人員解釋說細(xì)菌壁太厚沒打開，我認(rèn)為這個(gè)解釋有一定道理。從峰圖看銳利度明顯不夠，造成這個(gè)原因的因素有很多，試劑，反應(yīng)溫度，模板量都有可能。測(cè)序公司走樣都是模式化的也就是第一個(gè)啟動(dòng)cycle的時(shí)間可能就是3-5分鐘左右，后面的解鏈時(shí)間更短。如果第一次細(xì)胞沒打開后面可能要到多個(gè)循環(huán)后細(xì)胞才被裂開，最后峰圖可能就跑不出來。 3.個(gè)人建議你先采用上面網(wǎng)友提到的菌落PCR建議，第一個(gè)循環(huán)95度用10-15分鐘裂細(xì)胞從而增加模板濃度。如果能擴(kuò)出來基本就可以確定是模板量不夠?qū)е碌�。�?dāng)然菌落PCR也有干擾問題，如果直接PCR還沒有結(jié)果建議先用95度裂細(xì)胞10-15分鐘，然后離心取上清DNA做PCR模板減少其它細(xì)胞組分干擾。 |
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13樓2016-03-23 04:30:53
21樓2016-06-14 11:38:42
tkl0621
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2樓2016-03-20 13:02:56
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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自己培養(yǎng)。買dna提取試劑盒提dna自己pcr，把結(jié)果送去測(cè)序�，F(xiàn)在的公司都亂來的。試劑盒可以用mp的土壤dna提取試劑盒。普通的dna提取專用試劑盒不好提 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2016-03-20 13:13:09
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4樓2016-03-20 16:01:02
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5樓2016-03-20 16:03:18
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工作人員告訴我說甘油保存的菌里混有雜菌，測(cè)序干擾峰很多，不易區(qū)分到底是哪個(gè)菌種。這個(gè)到底應(yīng)該如何搞定，這家生物公司是北京鼎國生物，也是我?guī)熃阃扑]給我的。希望你能幫到我，或者指引我到比較正規(guī)的公司做，多謝了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-03-20 20:42:42
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9樓2016-03-21 06:18:24
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