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[求助]
關于質(zhì)粒構(gòu)建的疑難問題，求指點�。。�！ 已有2人參與
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請教質(zhì)粒構(gòu)建前輩~目前我想構(gòu)建某一基因的表達載體，已從cDNA上成功調(diào)取該基因，目標基因的大小是2000bp，想要構(gòu)建到VR1012（4900bp）這個真核表達載體上，使用PCR方法獲得酶切位點然后連入雙酶切的載體，PCR后核酸膠驗證目標條帶大小正確，膠回收，同時酶切載體膠回收，將目的基因的正義鏈與反義鏈退火（94℃ 10min, 25℃ 30min），連接載體，TOP10感受態(tài)轉(zhuǎn)化后，挑單克隆，鑒定（雙酶切以及菌液PCR）發(fā)現(xiàn)目標基因變短了！  測序發(fā)現(xiàn)基因變成了△975-1431nt缺失，少了456bp，反復了3次以上都是這樣，請問各位大牛有人知道這種情況是如何造成的？有什么方法能避免，我用相同的方法構(gòu)建了另外4個基因都沒有這樣的問題…… |
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蘭蘭園丁
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2016-03-21 08:43:48
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2016-03-21 08:43:48
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最大的可能就是你酶切位點選的不對，基因內(nèi)部可能還有一個位點，因此導致變短 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-03-21 00:10:09
siriusxuan
木蟲 (正式寫手)
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2樓2016-03-21 00:02:37
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4樓2016-03-21 06:03:40
5樓2016-03-21 16:19:41
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