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綠末未已新蟲 (初入文壇)
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WB結(jié)果 請(qǐng)教
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本人新手剛開始做，總是出現(xiàn)背景高，膜花花的情況 共有兩個(gè)目的蛋白一個(gè)內(nèi)參。 流程：1.10ul上樣量，80v，120v電泳。 2.半干轉(zhuǎn)膜20v，1h（操作中發(fā)現(xiàn)膜剪得比膠大太多，不知是否有影響），緩沖液浸透濾紙。 3.5%脫脂奶粉25度封閉3h（由于之前做的背景高選擇封閉時(shí)間加長(zhǎng)，之前一次37度2h），搖床震蕩。 4.一抗4度搖床孵育過夜，濃度兩個(gè)目的蛋白均為1：2000，內(nèi)參1：5000（也是由于之前背景高，一抗?jié)舛扔?：1000變?yōu)?：2000，以封閉液稀釋） 5.tbst洗滌10min*4次 6.二抗1：10000，室溫1h（18度左右，也是由于背景高嘗試的，之前37度2h） 7.tbst洗滌10min*4次 8.ecl曝光（蛋白1.蛋白2可能有曝光液太多的情況，沒有吸干，不知是否有影響） 貼上結(jié)果圖，希望大神們可以指導(dǎo)一下為什么會(huì)出現(xiàn)這些情況（PTEN出現(xiàn)條帶但是很花，p53是直標(biāo)一抗但也加了二抗還是沒有條帶，是否抗體不好，gapdh比較好看） 20160329.gadph.JPG 20160329.p53.JPG 20160329.pten.JPG |
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engreen2016
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2樓2016-08-03 09:34:35
liyushan1130
木蟲 (小有名氣)
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個(gè)人認(rèn)為主要和抗體有關(guān)。出現(xiàn)條帶的換BSA封閉試試，沒條帶的加大抗體用量。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-08-06 23:24:13
橙1子2
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4樓2017-06-20 18:02:12
chaosyw
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推薦一篇wb操作方面的綜述吧： https://www.labome.com/method/We ... s-and-Reagents.html |
5樓2017-06-20 18:59:02
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