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圓加leaf新蟲 (小有名氣)
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[交流]
想讓大腸桿菌表達(dá)它原來沒有的蛋白，是不是必需先構(gòu)建克隆載體再構(gòu)建表達(dá)載體？
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本人想轉(zhuǎn)一個(gè)新的基因進(jìn)大腸桿菌，讓他表達(dá)原來沒有的一種蛋白，研究它的代謝量。 方式是靠構(gòu)建質(zhì)粒，可是又看到有基因克隆載體，和表達(dá)載體，有點(diǎn)懵了，我是不是需要先用一個(gè)克隆載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞，讓他復(fù)制，然后再提這個(gè)基因，再用這基因構(gòu)建一個(gè)表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，然后才可以穩(wěn)定表達(dá)，研究代謝？！ 請(qǐng)各位前輩指導(dǎo)��！ |
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| 姑娘不需要，直接構(gòu)建表達(dá)載體就行，參考大腸桿菌蛋白表達(dá)操作流程步驟原理：http://www.detaibio.com/topics/dachangganjunbiaodaliucheng-sop.html |
3樓2016-03-30 10:27:50
MT233
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我基本上都是一步到位，直接到表達(dá)載體，表達(dá)菌種！然后測(cè)個(gè)序就ok了！前后估計(jì)做了百多個(gè)，木有問題！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2016-04-01 01:03:27
sihaiming
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2樓2016-03-30 10:21:03
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其實(shí)克隆載體的概念太大也模糊，本身表達(dá)載體就是一個(gè)普通的克隆載體呀，只不過它本身經(jīng)過改造了，相對(duì)其他克隆載體，在蛋白表達(dá)方面更有優(yōu)勢(shì)，但基本的克隆載體功能它也具有。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-03-30 12:24:49
圓加leaf
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5樓2016-03-30 13:41:13
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pET可以，但是大腸桿菌表達(dá)后一般目的蛋白都是以包涵體狀態(tài)聚集，沒有正確折疊，就沒有活性。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-03-31 15:01:46
圓加leaf
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8樓2016-04-01 11:17:46
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9樓2016-04-01 11:19:25
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額不是大神，只是略懂皮毛。 pET表達(dá)你的目的蛋白特異性很強(qiáng)的，表達(dá)量大速度快，所以會(huì)形成包涵體，導(dǎo)致沒活性。 感受態(tài)細(xì)胞可以用于構(gòu)建你的載體，不用于表達(dá)。表達(dá)宿主菌商業(yè)化的有BL21，ROSETTA等。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2016-04-01 15:41:22
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