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I-Believe

新蟲 (小有名氣)

[交流] 畢赤酵母表達抗菌肽，做了幾十次了，一直不表達

本人是做畢赤酵母表達抗菌肽的新手，從開始什么都不知道，到現(xiàn)在碰到各種問題，試驗操作上一些問題還可以看看論壇解決，但是這種表達不出來就不知道怎么解決了。
目的蛋白已經(jīng)在大腸桿菌成功表達，在畢赤酵母做了幾十次了，菌落PCR鑒定是陽性，誘導表達還是不表達，現(xiàn)在已經(jīng)沒有做實驗的激情了！��！
先說下自己試驗步驟吧：
1、構建載體，測序鑒定正確
2、線性化載體，乙醇沉淀回收、凝膠回收、DNA純化試劑盒回收都做過。
3、X33感受態(tài)制備
4、電擊：電壓2000V，電容25uF，電阻200，時間2
5、加山梨醇28度靜置1h，涂抗生素終濃度100的YPDS平板
6、培養(yǎng)2、3天只能長個位數(shù)的轉化子，效率太低了，自己也嘗試過提高DNA濃度，但是還是效率低
7、挑單菌落劃抗性平板，長出菌落后再做菌落PCR
8、鑒定陽性就BMGY/BMMY培養(yǎng)誘導，甲醇濃度1%。
9、SDS-PAGE鑒定上清和沉淀
10、結果NOTHING!!!!!
問題：1怎么提高轉化效率；2怎么改進鑒定是否表達




畢赤酵母表達抗菌肽，做了幾十次了，一直不表達
IMG_20160329_202711.jpg
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么么噠0120

銅蟲 (小有名氣)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
請問樓主做的怎么樣啦？我也在做，一開始篩選的陽性轉化子都能表達，保了甘油菌，過了三四個月，竟然都不表達了！pPICZaA載體，菌株GS115，PCR驗證目的基因是在的，希望能和高手們交流一下！
23樓2016-08-23 08:54:22
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冷雁孤旅

木蟲 (著名寫手)
qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

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3樓2016-04-01 16:37:39
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I-Believe

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
3樓: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2016-04-01 16:37:39
qi   dong   zi   shi   zhen  he  qidongzi

pPIC載體，啟動子沒問題。

發(fā)自小木蟲Android客戶端
4樓2016-04-01 17:08:29
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粒粒分明

新蟲 (初入文壇)
★
I-Believe(金幣+1): 謝謝參與
我也是做酵母的，從膠上看，是不是蛋白濃度低？請問你的體系多大？

發(fā)自小木蟲IOS客戶端
5樓2016-04-01 19:21:35
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素黑好好學習

新蟲 (初入文壇)
★
I-Believe(金幣+1): 謝謝參與
稀有密碼子的問題有沒有考慮過呢？

發(fā)自小木蟲IOS客戶端
8樓2016-04-01 21:32:12
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Cathering_w

新蟲 (正式寫手)
★
I-Believe(金幣+1): 謝謝參與
上樣量的問題是否考慮過

發(fā)自小木蟲Android客戶端
9樓2016-04-01 22:23:46
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I-Believe

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
5樓: Originally posted by 粒粒分明 at 2016-04-01 19:21:35
我也是做酵母的，從膠上看，是不是蛋白濃度低？請問你的體系多大？

上樣20微升

發(fā)自小木蟲Android客戶端
10樓2016-04-02 11:05:53
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I-Believe

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
8樓: Originally posted by 素黑好好學習 at 2016-04-01 21:32:12
稀有密碼子的問題有沒有考慮過呢？

優(yōu)化的也做了

發(fā)自小木蟲Android客戶端
11樓2016-04-02 11:06:19
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tableman

木蟲之王 (文學泰斗)
★
I-Believe(金幣+1): 謝謝參與
祝好了。
13樓2016-04-04 12:19:29
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lksyb

金蟲 (正式寫手)
★
I-Believe(金幣+1): 謝謝參與
用的什么質粒��？轉化后菌落只有個位數(shù)的話，感覺這步可能有問題。另外你的抗菌肽有辦法測定活性嗎？先確定一下是表達量低還是無表達

發(fā)自小木蟲Android客戶端
14樓2016-04-04 12:26:29
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baicai734

禁蟲 (小有名氣)
★
I-Believe(金幣+1): 謝謝參與
本帖內容被屏蔽
15樓2016-04-04 12:29:10
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I-Believe

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
15樓: Originally posted by baicai734 at 2016-04-04 12:29:10
檢測一下活性看看

是一種方法，可以試下

發(fā)自小木蟲Android客戶端
16樓2016-04-04 23:33:59
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I-Believe

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
14樓: Originally posted by lksyb at 2016-04-04 12:26:29
用的什么質粒��？轉化后菌落只有個位數(shù)的話，感覺這步可能有問題。另外你的抗菌肽有辦法測定活性嗎？先確定一下是表達量低還是無表達

謝謝你的建議，嘗試下吧，總比一個人沒有一點頭緒好

發(fā)自小木蟲Android客戶端
17樓2016-04-04 23:34:57
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fevil

木蟲 (著名寫手)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
有沒有可能是沒有整合到基因組上去呢？對你做的，很感興趣，有機會可以交流交流，

發(fā)自小木蟲Android客戶端
18樓2016-04-05 00:13:51
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luwei13566

木蟲 (正式寫手)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
1.轉化只長幾個轉化子絕對不正常，問題就在這里，篩查一下菌株和轉化條件有沒有問題吧！

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19樓2016-04-05 03:28:14
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I-Believe

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
18樓: Originally posted by fevil at 2016-04-05 00:13:51
有沒有可能是沒有整合到基因組上去呢？對你做的，很感興趣，有機會可以交流交流，

鑒定有些轉化子還是整合上了。是通過交叉引物和AOX做菌落PCR。
也希望可以相互交流

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20樓2016-04-05 11:15:37
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I-Believe

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
19樓: Originally posted by luwei13566 at 2016-04-05 03:28:14
1.轉化只長幾個轉化子絕對不正常，問題就在這里，篩查一下菌株和轉化條件有沒有問題吧！

請問篩選菌株什么意思？是轉化子還是感受態(tài)菌株

發(fā)自小木蟲Android客戶端
21樓2016-04-05 11:21:40
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I-Believe

新蟲 (小有名氣)
引用回帖:
14樓: Originally posted by lksyb at 2016-04-04 12:26:29
用的什么質粒�。哭D化后菌落只有個位數(shù)的話，感覺這步可能有問題。另外你的抗菌肽有辦法測定活性嗎？先確定一下是表達量低還是無表達

表達載體是pPIC

發(fā)自小木蟲Android客戶端
22樓2016-04-05 11:25:23
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kang139com

新蟲 (初入文壇)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
遇到同樣問題，同求。用了pGAPZaA和pPICZaA進行表達。宿主也用了X33和GS115。對表達盒測序沒問題，轉入的X33經(jīng)基因組DNA的PCR，再測序，也有目的基因。就是沒抑菌圈（金色葡萄球菌，地衣、大腸做為指示菌）....
24樓2016-08-30 08:34:57
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kang139com

新蟲 (初入文壇)
我轉化后，基本都有接近上百個轉化子。
25樓2016-08-30 08:36:43
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么么噠0120

銅蟲 (小有名氣)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
引用回帖:
24樓: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 08:34:57
遇到同樣問題，同求。用了pGAPZaA和pPICZaA進行表達。宿主也用了X33和GS115。對表達盒測序沒問題，轉入的X33經(jīng)基因組DNA的PCR，再測序，也有目的基因。就是沒抑菌圈（金色葡萄球菌，地衣、大腸做為指示菌）....

你的培養(yǎng)基和誘導條件是什么？誘導完怎么處理的表達液？有沒有濃縮或者進行別的處理？我也用過pGAPZaA的載體，用YPD誘導，沒有表達，pPICZaA是BMGY/BMMY，剛轉化長出的單克隆有表達，時間久了就不表達了。
26樓2016-08-30 08:51:32
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kang139com

新蟲 (初入文壇)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
你有沒有做抑菌實驗？
27樓2016-08-30 08:51:52
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kang139com

新蟲 (初入文壇)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
引用回帖:
26樓: Originally posted by 么么噠0120 at 2016-08-30 08:51:32
你的培養(yǎng)基和誘導條件是什么？誘導完怎么處理的表達液？有沒有濃縮或者進行別的處理？我也用過pGAPZaA的載體，用YPD誘導，沒有表達，pPICZaA是BMGY/BMMY，剛轉化長出的單克隆有表達，時間久了就不表達了。...

都是按照畢赤酵母的誘導條件，不過我有對pGAPZaA的進行補料！甲醇誘導額額就是按照說明書～但是，我的由始至終都沒抑菌圈！我直接用上清做抑菌實驗，電泳則用了上清和丙酮沉淀來濃縮～

發(fā)自小木蟲Android客戶端
28樓2016-08-30 09:02:57
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么么噠0120

銅蟲 (小有名氣)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
引用回帖:
27樓: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 08:51:52
你有沒有做抑菌實驗？

做了，但不是抑菌圈，是稀釋一定的大腸桿菌，和表達液混合，作用一段時間，涂板看個數(shù)
29樓2016-08-30 09:03:16
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kang139com

新蟲 (初入文壇)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
引用回帖:
29樓: Originally posted by 么么噠0120 at 2016-08-30 09:03:16
做了，但不是抑菌圈，是稀釋一定的大腸桿菌，和表達液混合，作用一段時間，涂板看個數(shù)...

你是標準方法嗎？實驗結果會不會有誤差？

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30樓2016-08-30 09:12:03
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kang139com

新蟲 (初入文壇)
引用回帖:
30樓: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 09:12:03
你是標準方法嗎？實驗結果會不會有誤差？
...

你的重組菌基本培養(yǎng)了多久？

發(fā)自小木蟲Android客戶端
31樓2016-08-30 09:13:00
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kang139com

新蟲 (初入文壇)
引用回帖:
29樓: Originally posted by 么么噠0120 at 2016-08-30 09:03:16
做了，但不是抑菌圈，是稀釋一定的大腸桿菌，和表達液混合，作用一段時間，涂板看個數(shù)...

重組菌培養(yǎng)了多少時間～

發(fā)自小木蟲Android客戶端
32樓2016-08-30 09:13:44
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么么噠0120

銅蟲 (小有名氣)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
引用回帖:
30樓: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 09:12:03
你是標準方法嗎？實驗結果會不會有誤差？
...

不知道是不是標準方法，但操作簡單，每次做都會有對照，也做平行，我只要檢測這批表達的有沒有活性。
33樓2016-08-30 15:28:00
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么么噠0120

銅蟲 (小有名氣)
引用回帖:
24樓: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 08:34:57
遇到同樣問題，同求。用了pGAPZaA和pPICZaA進行表達。宿主也用了X33和GS115。對表達盒測序沒問題，轉入的X33經(jīng)基因組DNA的PCR，再測序，也有目的基因。就是沒抑菌圈（金色葡萄球菌，地衣、大腸做為指示菌）....

你密碼子優(yōu)化了嗎？
34樓2016-08-30 15:29:01
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鬼羽帝魂

木蟲 (著名寫手)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
我轉化GS115后，菌液PCR鑒定都沒有目的帶，做了一百多個都沒有
35樓2016-08-30 16:34:05
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huyan0817

木蟲 (正式寫手)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
你的蛋白是否含有跨膜蛋白？如果有的話很難表達，另外如果你的蛋白好表達的話，就算整合率低也會表達，你的蛋白是否有辦法檢測呢？

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36樓2016-08-30 17:45:52
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kang139com

新蟲 (初入文壇)
引用回帖:
34樓: Originally posted by 么么噠0120 at 2016-08-30 15:29:01
你密碼子優(yōu)化了嗎？...

優(yōu)化了～

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37樓2016-08-31 00:23:28
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么么噠0120

銅蟲 (小有名氣)
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35樓: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2016-08-30 16:34:05
我轉化GS115后，菌液PCR鑒定都沒有目的帶，做了一百多個都沒有

電轉還是化學轉化？我用的LiCl轉化，每次加2ug的線性化質粒都會長上百個，而且大部分都是陽性。
38樓2016-08-31 15:49:20
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么么噠0120

銅蟲 (小有名氣)
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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37樓: Originally posted by kang139com at 2016-08-31 00:23:28
優(yōu)化了～
...

胞內檢測了嗎？如果確定自己每一步都沒有錯誤，那應該就是不表達了，或許不適合這個表達系統(tǒng)。我之前一直用釀酒酵母做的，怎么都不表達，所以換的畢赤酵母。
39樓2016-08-31 15:53:31
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kang139com

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39樓: Originally posted by 么么噠0120 at 2016-08-31 15:53:31
胞內檢測了嗎？如果確定自己每一步都沒有錯誤，那應該就是不表達了，或許不適合這個表達系統(tǒng)。我之前一直用釀酒酵母做的，怎么都不表達，所以換的畢赤酵母。...

那倒是沒做胞內的～

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40樓2016-08-31 16:43:17
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么么噠0120

銅蟲 (小有名氣)
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40樓: Originally posted by kang139com at 2016-08-31 16:43:17
那倒是沒做胞內的～
...

載體轉化的時候用的哪個限制性內切酶線性化？
41樓2016-09-02 14:02:24
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kang139com

新蟲 (初入文壇)
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41樓: Originally posted by 么么噠0120 at 2016-09-02 14:02:24
載體轉化的時候用的哪個限制性內切酶線性化？...

AVRII BglII

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42樓2016-09-02 15:09:08
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harry007

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電泳上樣量太少了

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43樓2016-09-03 22:42:10
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木子林夕lms

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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23樓: Originally posted by 么么噠0120 at 2016-08-23 08:54:22
請問樓主做的怎么樣啦？我也在做，一開始篩選的陽性轉化子都能表達，保了甘油菌，過了三四個月，竟然都不表達了！pPICZaA載體，菌株GS115，PCR驗證目的基因是在的，希望能和高手們交流一下！

請問一下你現(xiàn)在表達出來了嗎？我跟你一樣的情況，從5月份開始一直就在做表達，到現(xiàn)在還是沒有成功。
44樓2016-10-14 21:17:38
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木子林夕lms

新蟲 (初入文壇)
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24樓: Originally posted by kang139com at 2016-08-30 08:34:57
遇到同樣問題，同求。用了pGAPZaA和pPICZaA進行表達。宿主也用了X33和GS115。對表達盒測序沒問題，轉入的X33經(jīng)基因組DNA的PCR，再測序，也有目的基因。就是沒抑菌圈（金色葡萄球菌，地衣、大腸做為指示菌）....

我用是的pPICZaA進行表達，宿主是SMD1168。一直不表達，想問下你現(xiàn)在表達了嗎？
45樓2016-10-14 21:19:19
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菜頭Q

銅蟲 (初入文壇)
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23樓: Originally posted by 么么噠0120 at 2016-08-23 08:54:22
請問樓主做的怎么樣啦？我也在做，一開始篩選的陽性轉化子都能表達，保了甘油菌，過了三四個月，竟然都不表達了！pPICZaA載體，菌株GS115，PCR驗證目的基因是在的，希望能和高手們交流一下！

保存甘油菌時如果甘油濃度過大是會引起插入片段缺失的
46樓2017-12-13 13:57:00
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微微皮蛋

新蟲 (初入文壇)
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樓主，請問問題怎么解決的

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47樓2018-01-25 22:54:46
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www1223

新蟲 (小有名氣)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
樓主后來成功了嗎？

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48樓2018-03-22 10:09:43
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Xuxuxuing

新蟲 (初入文壇)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
請問樓主最終怎么解決的？
49樓2021-06-06 16:18:32
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abcjlm

銅蟲 (小有名氣)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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49樓: Originally posted by Xuxuxuing at 2021-06-06 16:18:32
請問樓主最終怎么解決的？

酵母表達小的抗菌肽還是蠻好表達的
50樓2021-06-06 17:02:14
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