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[交流]
畢赤酵母表達抗菌肽，做了幾十次了，一直不表達
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本人是做畢赤酵母表達抗菌肽的新手，從開始什么都不知道，到現在碰到各種問題，試驗操作上一些問題還可以看看論壇解決，但是這種表達不出來就不知道怎么解決了。 目的蛋白已經在大腸桿菌成功表達，在畢赤酵母做了幾十次了，菌落PCR鑒定是陽性，誘導表達還是不表達，現在已經沒有做實驗的激情了！�。� 先說下自己試驗步驟吧： 1、構建載體，測序鑒定正確 2、線性化載體，乙醇沉淀回收、凝膠回收、DNA純化試劑盒回收都做過。 3、X33感受態(tài)制備 4、電擊：電壓2000V，電容25uF，電阻200，時間2 5、加山梨醇28度靜置1h，涂抗生素終濃度100的YPDS平板 6、培養(yǎng)2、3天只能長個位數的轉化子，效率太低了，自己也嘗試過提高DNA濃度，但是還是效率低 7、挑單菌落劃抗性平板，長出菌落后再做菌落PCR 8、鑒定陽性就BMGY/BMMY培養(yǎng)誘導，甲醇濃度1%。 9、SDS-PAGE鑒定上清和沉淀 10、結果NOTHING!!!!! 問題：1怎么提高轉化效率；2怎么改進鑒定是否表達  IMG_20160329_202711.jpg |
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冷雁孤旅2樓
2016-04-01 16:36
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兩腳泥day6樓
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阿爾法XMC12樓
2016-04-04 12:09
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