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[求助]
最近做重組PCR，共五個(gè)片段，最終把全長(zhǎng)擴(kuò)出后做模板就擴(kuò)不出了
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前四個(gè)片段較小，分別有170；150；110和160，是逐一進(jìn)行片段重組的，因?yàn)槠?和4同源性太高，四個(gè)重組完成后進(jìn)行了TA克隆，測(cè)序后證明這四個(gè)片段成功重組， 可是，重點(diǎn)來(lái)了， 我第五個(gè)片段長(zhǎng)1894bp，從克隆載體上擴(kuò)下來(lái)的上述片段再與第五個(gè)片段重組，Okay，有清晰特異明亮的條帶，且長(zhǎng)度上相一致， 這個(gè)時(shí)候還好啊，我就又進(jìn)行了TA克隆，問題來(lái)了，抗性的板子上長(zhǎng)出很多菌落，我挑出10個(gè)菌落做菌P，只有兩個(gè)是陽(yáng)性，用的是我擴(kuò)增全長(zhǎng)的引物，（這個(gè)時(shí)候是懷疑的，TA克隆不至于這么低吧），再提質(zhì)粒，酶切顯示只是個(gè)空載體，求大神指示，哪里出了問題了啊…… 還有一個(gè)值得關(guān)注的問題，我再以擴(kuò)出全長(zhǎng)（五個(gè)片段組裝完成）的產(chǎn)物做模板，用最上游和最下游引物，再次進(jìn)行PCR的時(shí)候，沒有特異帶，完全彌散，急求指點(diǎn) |
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憤怒的小怪獸
新蟲 (初入文壇)
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2樓2017-04-27 13:58:25
3樓2017-06-20 10:47:14
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