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最近做重組PCR，共五個片段，最終把全長擴出后做模板就擴不出了
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前四個片段較小，分別有170；150；110和160，是逐一進行片段重組的，因為片段2和4同源性太高，四個重組完成后進行了TA克隆，測序后證明這四個片段成功重組， 可是，重點來了， 我第五個片段長1894bp，從克隆載體上擴下來的上述片段再與第五個片段重組，Okay，有清晰特異明亮的條帶，且長度上相一致， 這個時候還好啊，我就又進行了TA克隆，問題來了，抗性的板子上長出很多菌落，我挑出10個菌落做菌P，只有兩個是陽性，用的是我擴增全長的引物，（這個時候是懷疑的，TA克隆不至于這么低吧），再提質(zhì)粒，酶切顯示只是個空載體，求大神指示，哪里出了問題了啊…… 還有一個值得關(guān)注的問題，我再以擴出全長（五個片段組裝完成）的產(chǎn)物做模板，用最上游和最下游引物，再次進行PCR的時候，沒有特異帶，完全彌散，急求指點 |
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憤怒的小怪獸
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2樓2017-04-27 13:58:25
3樓2017-06-20 10:47:14
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