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小木蟲論壇-學術(shù)科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 分子生理 » 雙酶切切不開
| 查看: 1994 | 回復(fù): 18 | ||
博克儂浮碼銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙酶切切不開 已有1人參與
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| 做雙酶切，用的NEB的Bgl II和Nsil ，兩種酶都是同一種buffer3.1，但是為啥死活切不開，雙酶切體系20ul與50ul的都試過了，實在找不出原因。 |
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atlanticwi
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2樓2016-05-05 18:24:22
sunguangchao
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15樓2016-05-10 05:22:03
atlanticwi
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1）如果你拿過來能切開，轉(zhuǎn)大腸桿菌后再提質(zhì)粒，切不開，問題肯定在你這邊。兩種酶不存在甲基化影響，也就是你轉(zhuǎn)什么類型的宿主大腸桿菌應(yīng)該都沒問題。所以只有一點，她給你的質(zhì)粒不純，你提質(zhì)粒的那個單菌落就是不對的。要質(zhì)粒的同時要圖譜是必須要做的事情。尤其是自己轉(zhuǎn)化的這種，必須用多對酶切組合，證明質(zhì)粒是對的。 2）沒有在NEB的說明書上看到這兩個酶有什么問題。你非要用的話，建議做兩個實驗（先證明你的質(zhì)粒是對的） 其一，先加入一個酶酶切后，保證酶切完全的時間即可，失活第一個酶，再加入第二個酶（直接加酶，因為Buffer一樣），酶切完全的時間反應(yīng)后，看結(jié)果。 其二，先加入一個酶酶切后，保證酶切完全的時間即可，PCR純化柱回收DNA后，重新加第二個酶的反應(yīng)體系作反應(yīng)。看結(jié)果。 |
17樓2016-05-10 23:11:01
娟戀幸福
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3樓2016-05-05 23:49:30
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4樓2016-05-05 23:57:16
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5樓2016-05-05 23:58:27
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8樓2016-05-07 19:24:13
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9樓2016-05-07 21:10:03
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10樓2016-05-08 17:01:15
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