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[求助]
質(zhì)粒切不開 已有4人參與
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內(nèi)切酶用的XbaI，位于我的目的基因兩邊，測序結(jié)果表明酶切位點(diǎn)序列正確，兩邊也沒有甲基化位點(diǎn)，想用XbaI進(jìn)行酶切，但調(diào)整質(zhì)粒濃度，酶量，反應(yīng)體系，酶切時(shí)間，更換新的內(nèi)切酶，始終切不開，求教各位高手 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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你的基因是連在質(zhì)粒載體上對吧，這兩個(gè)xbai位點(diǎn)是質(zhì)粒上的？還是你插入的目的基因上的？所謂的切開，是電泳顯示把你目的基因切下來？不清楚你進(jìn)行酶切的目的是做什么，如果是酶切驗(yàn)證克隆，可以更換其他酶來處理，只要能切出正確大小即可。如果是為了回收目的片段進(jìn)行亞克隆，我不清楚為什么選擇單酶切，當(dāng)然實(shí)在切不下來，你可以通過pcr擴(kuò)增來獲得目的片段。對于你說的切不開，我猜測的原因:測序顯示酶切位點(diǎn)正確，其實(shí)這個(gè)不應(yīng)該是在你測序前就已經(jīng)構(gòu)建好正確的圖譜了么，除非你的目的基因是未知序列，然后測序結(jié)果來和你的理論序列對比看是否正確，而且測序結(jié)果最好有平行的，一個(gè)測序結(jié)果通常說服力太小。另一個(gè)就是要你確定這個(gè)酶切位點(diǎn)是否被甲基化，，畢竟xbai還是非常容易被甲基化或者其他修飾的，可以參考這個(gè)酶的說明書，盡量在甲基化缺陷的感受態(tài)進(jìn)行克隆，祝好！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2016-05-31 07:35:21
tfytli
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你用的哪個(gè)公司的酶？多大的體系？質(zhì)粒及酶的用量是多少？這些細(xì)節(jié)要說清楚我們才好判斷。這個(gè)酶我常用，沒有切不開的情況，算是比較常用的酶。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-05-29 23:07:32
3樓2016-05-30 07:52:44
tfytli
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你用同樣的酶量和質(zhì)粒量，換50微升體系試試，切的時(shí)間盡量長一點(diǎn)。用的酶量不應(yīng)超過體系的十分之一，會(huì)影響酶切效果。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-05-30 09:15:54
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