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新蟲 (初入文壇)

應(yīng)助: 0 (幼兒園)
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帖子: 7
在線: 2.4小時(shí)
蟲號(hào): 4098319
注冊(cè): 2015-09-24
專業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)

[求助] 求助！小鼠腦組織石蠟切片染色脫片、爛片已有2人參與

protocol如下：

灌注取腦后，4%多聚甲醛4℃固定24-48h。修塊3-4mm。

脫水（常溫）：45%、55%、65%、75%、85%、95%、100%酒精各30min；

透明（常溫）：（100%酒精+二甲苯）/2  10min，二甲苯①20min，二甲苯②至完全透明（約20min）

浸蠟（60℃）：（二甲苯+石蠟①）/2 10min，石蠟①30min，石蠟②40min；石蠟①為低熔點(diǎn)，石蠟②為高熔點(diǎn)

包埋：浸蠟后用石蠟②手動(dòng)包埋；

切片厚度：6um、（8um也切的有）

展片：40℃水中展片；

烤片：60攝氏度烤片機(jī)側(cè)烤約5min后吸去水分，轉(zhuǎn)移至60℃溫箱烤約4h；

脫蠟：烤片后趁蠟未凝固，進(jìn)行脫蠟。二甲苯 5min×2，100%酒精 3min，95%酒精 2min，

85%酒精    2min，75%酒精    2min，流水沖洗 2min（放在缸子里用水泡的，換了幾次水）；

染色：

HE染色：蘇木精    5-8min（新配為5min，時(shí)間長(zhǎng)可為8min，用前過(guò)濾），流水沖洗 3min

1%鹽酸酒精分化  5s，流水沖洗 1min，0.1%伊紅    1-2min，

脫水：85%酒精    2min，95%酒精    2min，100%酒精    2min，

100%無(wú)水乙醇：二甲苯（1:1） 2min

透明：二甲苯（I）    3min，二甲苯（II）       3min ；

CV染色：浸入CV染液中    10-20min，

脫水： 75%乙醇    2min， 85%乙醇    2min，95%乙醇    2min，100%無(wú)水乙醇    2min，

100%無(wú)水乙醇：二甲苯（1:1）    2min

透明：二甲苯（I）    3min，二甲苯（II）    3min；

封片：中性樹膠封片（整個(gè)染色過(guò)程避免干片）。

部分HE染色、CV染色片子結(jié)果如圖（附件）所示，基本上沒(méi)有完整的片子（染色時(shí)，片子隨著在液體里的時(shí)間脫片、爛片的程度加深），另CV染色著色淺。

請(qǐng)教論壇大神是什么原因？哪里出了問(wèn)題，該怎么解決？

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回復(fù)此樓

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1樓 2016-05-31 23:43:14

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

笑笑12345

新蟲 (小有名氣)

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專業(yè): 巖土與基礎(chǔ)工程

引用回帖:

2樓: Originally posted by zhangalading at 2016-06-01 00:29:46
二甲苯透明時(shí)間好久啊，我們都在10min內(nèi)，切片不會(huì)易碎嗎？我們都切4-5微米，不過(guò)我們是肝腎肺皮等，沒(méi)做過(guò)腦子～

4-5um不會(huì)容易皺一塊嗎？我們切得時(shí)候片子總是皺一塊

贊一下

回復(fù)此樓

19樓2017-05-17 10:09:45

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