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lanwang新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR一直跑不出來，排除了該排除的原因了還是跑不出來 已有7人參與
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| 我最近在提取黑曲霉基因組DNA，克隆特定的葡萄糖氧化酶基因，但我的菌株是菌種保藏中心購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌株，不是克隆我需要的特定基因的特定菌株，我開始提的RNA，再反轉(zhuǎn)錄成CDNA跑PCR,退火溫度跑的是55-65℃的梯度，用的10微升體系，沒跑出來，后來又提的DNA,同樣是跑的溫度梯度，我需要的目的基因是1818bp，所以用的是高保真酶，引物也設(shè)計(jì)了好幾對(duì)了，都是公司幫設(shè)計(jì)的，應(yīng)該沒問題，CDNA和DNA的濃度以及OD值都正常，但是不管用什么方法都跑不出來，求大神啊，真不知道該怎么辦了，試驗(yàn)就卡在第一步了，好焦心吶�。。。�！電泳圖上除了marker就什么都沒有了，有時(shí)候有引物二聚體 |
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yesucao
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+3, 贈(zèng)人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。myprayer祝您科研順利，文章多多。 2016-06-01 22:27:08
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-07-17 08:03:46
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+3, 贈(zèng)人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。myprayer祝您科研順利，文章多多。 2016-06-01 22:27:08
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-07-17 08:03:46
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一般這種常見的基因沒必要自己設(shè)計(jì)引物，搜索相關(guān)的文獻(xiàn)均可以查找到設(shè)計(jì)好且條件成熟的引物，核對(duì)一下引物序列和擴(kuò)增條件，沒有問題就可以采用，我查找到的網(wǎng)站鏈接如下：http://www.docin.com/p-1350669733.html； 僅供樓主參考，以DNA為模板，建議反應(yīng)體系加大到30ul，畢竟PCR擴(kuò)增產(chǎn)物還是需要測(cè)序驗(yàn)證一下才行。 |
6樓2016-06-01 22:07:46
2樓2016-06-01 15:34:52
lanwang
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3樓2016-06-01 15:42:47
4樓2016-06-01 15:45:01
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5樓2016-06-01 15:46:30
lanwang
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7樓2016-06-02 10:20:29
8樓2016-06-02 11:46:47
tangbowen
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9樓2016-06-02 11:57:02
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【答案】應(yīng)助回帖
★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-06-04 22:07:21
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-06-04 22:07:21
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先換酶試試，高保真也有不同品牌~或者先用非高保真的看能不能擴(kuò)出來，還不能可能就是模板問題了 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
10樓2016-06-02 12:20:11
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