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葉小蟲(chóng)10新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
基因克隆求助 已有1人參與
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用高保真酶克一段序列，前面兩次跑出來(lái)序列很清楚，第一張為前面兩次，但是連接轉(zhuǎn)化菌液監(jiān)測(cè)都沒(méi)有目的條帶，之后又用普通酶拉條帶以及用高保真酶跑，但是就是跑不出原來(lái)的條帶了，第二張是跑不出來(lái)的結(jié)果。能請(qǐng)牛人給點(diǎn)意見(jiàn)唄 @biostar2009 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
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2樓2016-06-02 20:06:26
zjsy_xff
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西門(mén)吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-06-24 07:46:40
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用高保真酶擴(kuò)增一般沒(méi)有a尾，樓主用的什么克隆載體。拉基因的模版是什么？第二次是否模板反復(fù)凍融有降解 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
3樓2016-06-02 22:48:22
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-06-24 07:47:03
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-06-24 07:47:03
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樓主糾結(jié)這個(gè)問(wèn)題前，是要先確定你的克隆或者模板是否攜帶了你的目的基因。你克隆菌液做pcr檢測(cè)，目的就是為了驗(yàn)證這個(gè)克隆是否正確么？如果是這個(gè)目的話，出現(xiàn)擴(kuò)增不出來(lái)的情況很正常呀，畢竟會(huì)出現(xiàn)空載假陽(yáng)性的。另一種可能就是菌液pcr準(zhǔn)確度不高，你可以提質(zhì)粒做pcr和酶切驗(yàn)證，如果還沒(méi)有目的條帶，那就證明你這個(gè)克隆子是錯(cuò)誤的呀，出現(xiàn)擴(kuò)增不出來(lái)也就屬于正�，F(xiàn)象了，祝好！ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
4樓2016-06-02 23:17:11
葉小蟲(chóng)10
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5樓2016-06-03 10:53:28
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6樓2016-06-03 10:54:15
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我用的是平末端載體，之后的模版也跑內(nèi)參驗(yàn)證了，所以很疑惑不知道哪里出問(wèn)題了，一樣的條件怎么就跑不出來(lái)了呢 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
7樓2016-06-03 10:55:32
胡建琴
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8樓2016-06-04 09:01:42
ss2032
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9樓2016-06-23 20:26:25
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-06-24 07:47:27
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-06-24 07:47:27
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你做菌液pcr用的是什么引物呢？特異性引物還是通用性引物，如果通用引物可以做一個(gè)對(duì)照，看看非特異性條帶是不是在其他菌中也存在，另外可以用你目的條帶特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。當(dāng)然我還是認(rèn)為菌液pcr結(jié)果僅供參考，你還是要依賴提質(zhì)粒做酶切，和后面的測(cè)序分析才可以，祝好！ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
10樓2016-06-23 20:42:23
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