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xqiongwei鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
大引物PCR建立隨機(jī)突變庫(kù) 已有3人參與
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小妹最近在建立隨機(jī)突變庫(kù)，先是易錯(cuò)PCR，得到300bp左右的隨機(jī)突變混合物，切膠純化后將此混合物作為大引物，運(yùn)用MEGAWHOP的方法進(jìn)行全質(zhì)粒PCR。然而問(wèn)題來(lái)了，點(diǎn)樣孔處很亮，其他地方看不到特異性的條帶，然而，用未突變的片段作為引物是可以做出來(lái)的，已上圖。我試過(guò)56度、68度、72度退火溫度，都不行，快崩潰了，求大師指導(dǎo)一二。感激不盡。 圖片1.png |
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2樓2016-06-05 12:19:58
xqiongwei
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3樓2016-06-06 10:58:52
【答案】應(yīng)助回帖
★
xn8008: 金幣+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-06-28 07:04:50
xn8008: 金幣+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-06-28 07:04:50
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估計(jì)跟二次PCR有關(guān)系，類(lèi)似拿PCR產(chǎn)物加引物再擴(kuò)增有時(shí)候又得不到目的帶一樣。不過(guò)，你都膠回收過(guò)了，除非膠回收的片段不對(duì)�？紤]到上樣孔有亮帶，建議大引物PCR突變后，用單位點(diǎn)酶切一下，看看是不是變成多聚體了，如果是，膠回收連接后再轉(zhuǎn)化看看。 |
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xqiongwei4樓2016-06-06 18:14:52
xqiongwei
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5樓2016-06-07 13:13:57
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6樓2016-06-21 15:12:53
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7樓2016-06-28 04:00:54
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8樓2017-04-21 10:32:25
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9樓2018-09-11 16:43:45
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