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xqiongwei鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
大引物PCR建立隨機(jī)突變庫(kù) 已有3人參與
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小妹最近在建立隨機(jī)突變庫(kù)，先是易錯(cuò)PCR，得到300bp左右的隨機(jī)突變混合物，切膠純化后將此混合物作為大引物，運(yùn)用MEGAWHOP的方法進(jìn)行全質(zhì)粒PCR。然而問(wèn)題來(lái)了，點(diǎn)樣孔處很亮，其他地方看不到特異性的條帶，然而，用未突變的片段作為引物是可以做出來(lái)的，已上圖。我試過(guò)56度、68度、72度退火溫度，都不行，快崩潰了，求大師指導(dǎo)一二。感激不盡。 圖片1.png |
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新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 23
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- 蟲(chóng)號(hào): 7033809
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- 專(zhuān)業(yè): 微生物學(xué)
9樓2018-09-11 16:43:45
2樓2016-06-05 12:19:58
xqiongwei
鐵蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 8.1
- 散金: 18
- 帖子: 89
- 在線: 21.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1940930
- 注冊(cè): 2012-08-16
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 免疫生物學(xué)
3樓2016-06-06 10:58:52
【答案】應(yīng)助回帖
★
xn8008: 金幣+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-06-28 07:04:50
xn8008: 金幣+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-06-28 07:04:50
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估計(jì)跟二次PCR有關(guān)系，類(lèi)似拿PCR產(chǎn)物加引物再擴(kuò)增有時(shí)候又得不到目的帶一樣。不過(guò)，你都膠回收過(guò)了，除非膠回收的片段不對(duì)。考慮到上樣孔有亮帶，建議大引物PCR突變后，用單位點(diǎn)酶切一下，看看是不是變成多聚體了，如果是，膠回收連接后再轉(zhuǎn)化看看。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
xqiongwei4樓2016-06-06 18:14:52
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