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zy晨曦新蟲 (小有名氣)
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[交流]
自己的初次蛋白純化實驗 已有2人參與
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通過上一次的蛋白純化，發(fā)現(xiàn)酶活的回收率低（目前沒有著重考察純度的問題），所以今天通過降低ph來考察酶活的回收率的問題。通過一天的不間斷的實驗，發(fā)現(xiàn)降低ph能快速洗脫目的蛋白，但是純化還沒有測定。先說說具體的步驟吧。 首先調(diào)整了弱陰離子樹脂的ph為7.0，還是將樹脂倒出然后直接調(diào)ph的方法，粗糙而又快速的方法。 調(diào)整酶液的ph有點問題，因為利用3M鹽酸調(diào)整會出現(xiàn)渾濁，主要是因為強酸會導(dǎo)致局部ph過低，酶變性了。所以我利用0.05m的磷酸氫二鉀調(diào)整ph。成功。 上柱300ml，比上次的柱子上的酶液體積多了100ml，但是酶活略微低于上一個酶液。總體算來，兩者的上樣量差不多。但是洗脫規(guī)律卻差了很多 0.2m氯化鈉就能洗脫出30%的目的蛋白，0.3m氯化鈉在第一個0.5BV時就洗脫出45%的目的蛋白，雖然心里在懷疑這個ph不適合，但是畢竟洗脫出來的酶活高，濃度大，接著0.3M洗脫的第二個0.5BV就沒有酶活了，說明洗脫過快。如果可以下次應(yīng)該改用0.25M洗脫了。接下來的0.4M就沒有洗脫出來蛋白�；驹�0.3M就洗脫出來了全部的蛋白，但是還是有20%左右的酶活不知道在哪里？酶在和我玩捉迷藏，而樹脂一直幫著它，我是孤家寡人了。 |
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沒弄明白為什么把填料弄出來換ph環(huán)境？離子交換兩種洗脫方法，鹽洗脫和ph洗脫。鹽是改變環(huán)境電導(dǎo)，ph是改變蛋白帶電。直接往柱子里泵緩沖液就可以的，為什么要拆出來呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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3樓2016-06-09 14:22:51
zy晨曦
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4樓2016-06-11 20:03:55
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5樓2016-06-11 20:07:00
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6樓2016-06-12 09:46:06
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7樓2016-06-12 20:14:40
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