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西大慢慢鐵蟲 (著名寫手)
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[求助]
怎么鑒定crispr/cas9單敲和雙敲小鼠 已有1人參與
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各位大神，我想請(qǐng)教一個(gè)問題，我目前通過crispr/cas9系統(tǒng)敲除了小鼠某個(gè)基因，通過PCR獲得了該基因的片段，通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)敲除的片段只有20bp,因此不能通過凝膠電泳分離目的基因鑒定小鼠屬于野生，單敲，雙敲（如果敲除的片段足夠大，通過凝膠電泳可以發(fā)現(xiàn)，雙敲的片段小跑的距離遠(yuǎn)，野生的片段大跑的慢，單敲的會(huì)出現(xiàn)兩條帶從而鑒別開來）。但通過測(cè)序我們可以鑒定出野生型以及單敲、雙敲，而不能區(qū)分雙敲和單敲，因?yàn)樗鼈兊臏y(cè)序結(jié)果在敲除片段的峰都是雜峰。因而，我們將PCR產(chǎn)物通過TA克隆然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中培養(yǎng)，然后隨機(jī)的挑選菌落，每個(gè)菌落培養(yǎng)后，再測(cè)序，并且與該基因序列對(duì)比，如果有一條序列不完整為單敲，兩條不完整為雙敲。然后我的問題是，通過TA克隆的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，連接不同的基因型載體的大腸桿菌是分布在不同的菌落嗎？或者換句話說，將不同大小的基因片段克隆在同一種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，在同一個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，它們會(huì)分布在不同的菌落上嗎？或者你們是怎樣鑒定這種小鼠基因型的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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我們?cè)瓉硎窃谶@20bp的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，如果不能pcr出來說明雙敲，p出來量少為單敲，量多為野生 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-06-12 09:03:15
armigera
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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。祝您科研順利，文章多多。 2016-06-12 19:38:46
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。祝您科研順利，文章多多。 2016-06-12 19:38:46
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每個(gè)菌落都是由一種菌生長(zhǎng)起來的，而每個(gè)菌里面的質(zhì)粒在你能看到菌落的時(shí)候都是單一的（因?yàn)橛匈|(zhì)粒不兼容性），所以你這個(gè)方法理論上是可以的。可能會(huì)遇到不同大小質(zhì)粒分布數(shù)量不同，但你這是定性實(shí)驗(yàn)，多挑幾個(gè)就能解決。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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西大慢慢2樓2016-06-12 09:00:28
西大慢慢
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4樓2016-06-12 10:36:38
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5樓2016-06-12 10:38:07
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