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西大慢慢鐵蟲 (著名寫手)
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怎么鑒定crispr/cas9單敲和雙敲小鼠 已有1人參與
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各位大神，我想請教一個問題，我目前通過crispr/cas9系統(tǒng)敲除了小鼠某個基因，通過PCR獲得了該基因的片段，通過測序發(fā)現(xiàn)敲除的片段只有20bp,因此不能通過凝膠電泳分離目的基因鑒定小鼠屬于野生，單敲，雙敲（如果敲除的片段足夠大，通過凝膠電泳可以發(fā)現(xiàn)，雙敲的片段小跑的距離遠(yuǎn)，野生的片段大跑的慢，單敲的會出現(xiàn)兩條帶從而鑒別開來）。但通過測序我們可以鑒定出野生型以及單敲、雙敲，而不能區(qū)分雙敲和單敲，因為它們的測序結(jié)果在敲除片段的峰都是雜峰。因而，我們將PCR產(chǎn)物通過TA克隆然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中培養(yǎng)，然后隨機的挑選菌落，每個菌落培養(yǎng)后，再測序，并且與該基因序列對比，如果有一條序列不完整為單敲，兩條不完整為雙敲。然后我的問題是，通過TA克隆的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，連接不同的基因型載體的大腸桿菌是分布在不同的菌落嗎？或者換句話說，將不同大小的基因片段克隆在同一種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，在同一個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，它們會分布在不同的菌落上嗎？或者你們是怎樣鑒定這種小鼠基因型的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。祝您科研順利，文章多多。 2016-06-12 19:38:46
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每個菌落都是由一種菌生長起來的，而每個菌里面的質(zhì)粒在你能看到菌落的時候都是單一的（因為有質(zhì)粒不兼容性），所以你這個方法理論上是可以的。可能會遇到不同大小質(zhì)粒分布數(shù)量不同，但你這是定性實驗，多挑幾個就能解決。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-06-12 09:00:28
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用酶切的方法可以嗎？講靶位點上下的一小段序列擴增出來，因為片段小，然后搜尋只在靶位點工作的酶切酶，酶切后，敲出的應(yīng)該不會發(fā)生酶切的。所以如果單敲的應(yīng)該有三條帶，雙敲的只有一條帶。你覺得可以嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2016-06-15 21:23:57
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