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[求助]
關(guān)于在pET28b載體蛋白表達(dá)的問題，求助
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各位蟲友 最近做蛋白在pET-28b表達(dá)，c端融合蛋白 現(xiàn)在我的目的基因在pGEM－T載體上，想直接酶切NcoI和sacI得到目的基因，然后跟pet28連接 現(xiàn)在的問題是，蛋白表達(dá)是在NcoI處開始嗎，但是后面我的基因啟動(dòng)子在離NcoI大概100bp 這個(gè)時(shí)候，蛋白表達(dá)會(huì)受影響嗎，還是說不能表達(dá) 謝謝各位了 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★
xn8008: 金幣+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 歡迎積極回帖 2016-06-21 08:40:52
xn8008: 金幣+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 歡迎積極回帖 2016-06-21 08:40:52
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1) 28b 是N，C端均融合6xHis吧，所以你做C端融合用這個(gè)是否不合適？ 2) 正因?yàn)橐灿蠳端融合的，所以是從NcoI的ATG開始算起的。 3) 我估計(jì)你是想直接切掉NcoI然后用你自己的基因代替NcoI的ATG，以達(dá)到C-端融合目的。但pET系列有單純的C-端融合吧(我記得)，干嗎這么費(fèi)勁？ 4) 你原理搞不清，原核表達(dá)系統(tǒng)直接利用CDS往上連接，與融合標(biāo)簽通讀就可以，哪里需要啟動(dòng)子區(qū)域？（還是說你沒表述清楚，你是否想說起始密碼子？） |
2樓2016-06-20 19:51:58
★
xn8008: 金幣+1, 歡迎積極交流 2016-06-21 08:41:10
xn8008: 金幣+1, 歡迎積極交流 2016-06-21 08:41:10
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1.酶切NcoI位點(diǎn)把N端his切掉了的。 2.我之前設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)載體NcoI和NotI的引物，BspHI和NotI，PCR出來了老師不讓我直接連pET。。。。。 3.現(xiàn)在目的基因在pGEM載體上，用NcoI切可以得到目的片段，但是在目的基因歧視密碼子前面有一段基因，并不是取代NcoI的ATG，我現(xiàn)在只有pET28b。 4.所以我想問一下NcoI的ATG和我的目的基因的ATG表達(dá)會(huì)有什么影響 最后一個(gè)是我最關(guān)心的，我不太理解到底蛋白表達(dá)開始在哪個(gè)ATG 表達(dá)不清楚，請(qǐng)見諒 謝謝幫助 |
3樓2016-06-21 08:29:59
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