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z631535213木蟲 (正式寫手)
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[求助]
關于簡并引物的一點疑問，求幫忙。
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樓準備設計的簡并引物是用來擴增 已知基因序列 。但是由于病毒的亞型比較多，所以用簡并引物。第一次接觸簡并引物，有點疑問想請教下大家： Q1. 兼并堿基能否相鄰的連續(xù)出現?（比如5-ATCGRRATCGYYATCGATCG-3) Q2.針對于我的這個實驗——已知基因序列，簡并度一般多少比較合適？還是說沒有一個定值。（初步定的一條簡并引物序列為 5-AABV AWAAAAABAAAAA-3 其中A是已確定的堿基 。簡并度 3*3*2*3=54？ ） Q3.能參考下大家做過的兼并引物的實驗數據嗎？比如簡并度是多少以及對應的引物使用濃度。樓之前接觸的都是常規(guī)PCR，一般都是30ul體系含有0.75ul 10uM的正（or反）引物。 |
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【答案】應助回帖
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xn8008: 應助指數+1 2016-07-18 20:42:51
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A1.簡并堿基可以連續(xù)出現。 A2.簡并度一般100以內較好，不過你的這個引物怎么除了簡并堿基全是A，擴增效率可能會很不好，建議換引物，注意四種堿基數量平衡。 A3.簡并度100以內的引物，使用時和普通引物一樣使用，30ul體系上下游引物可各加1ul 10uM。 |
2樓2016-07-18 15:22:04
z631535213
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3樓2016-07-18 16:12:48
z631535213
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xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-07-18 20:43:19
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A3中你說“30ul體系上下游引物可各加1ul 10uM”，那我平時做常規(guī)PCR所用體系中的引物是不是加的過量了。 因為之前和生工聯系過，ta那邊有提過“ Y/R/K/M 之類的都屬于簡并堿基，以Y為例，此堿基表示C和T的簡并，我們合成的時候，這2個單體都是同時進樣的，比例是1:1的，但是產物是隨機的。含有簡并堿基的這條鏈，嚴格來說，相當于幾條鏈的混合物的�！� 那簡并度為8的引物配成10uM時溶液中個引物濃度 應該是簡并度為1的引物配成10uM時溶液的 1/8 ？請問下我這個理解有沒有問題啊。 |
4樓2016-07-18 16:17:56
z631535213
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