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z631535213木蟲 (正式寫手)
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[求助]
關(guān)于簡并引物的一點(diǎn)疑問，求幫忙。
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樓準(zhǔn)備設(shè)計(jì)的簡并引物是用來擴(kuò)增 已知基因序列 。但是由于病毒的亞型比較多，所以用簡并引物。第一次接觸簡并引物，有點(diǎn)疑問想請教下大家： Q1. 兼并堿基能否相鄰的連續(xù)出現(xiàn)?（比如5-ATCGRRATCGYYATCGATCG-3) Q2.針對于我的這個實(shí)驗(yàn)——已知基因序列，簡并度一般多少比較合適？還是說沒有一個定值。（初步定的一條簡并引物序列為 5-AABV AWAAAAABAAAAA-3 其中A是已確定的堿基 。簡并度 3*3*2*3=54？ ） Q3.能參考下大家做過的兼并引物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)嗎？比如簡并度是多少以及對應(yīng)的引物使用濃度。樓之前接觸的都是常規(guī)PCR，一般都是30ul體系含有0.75ul 10uM的正（or反）引物。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。祝您科研順利，文章多多。 2016-07-18 15:49:42
z631535213: 金幣+20, ★★★很有幫助, 謝謝 2016-07-18 16:10:58
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-07-18 20:42:51
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xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-07-18 20:42:51
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A1.簡并堿基可以連續(xù)出現(xiàn)。 A2.簡并度一般100以內(nèi)較好，不過你的這個引物怎么除了簡并堿基全是A，擴(kuò)增效率可能會很不好，建議換引物，注意四種堿基數(shù)量平衡。 A3.簡并度100以內(nèi)的引物，使用時和普通引物一樣使用，30ul體系上下游引物可各加1ul 10uM。 |
2樓2016-07-18 15:22:04
z631535213
木蟲 (正式寫手)
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3樓2016-07-18 16:12:48
z631535213
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xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-07-18 20:43:19
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A3中你說“30ul體系上下游引物可各加1ul 10uM”，那我平時做常規(guī)PCR所用體系中的引物是不是加的過量了。 因?yàn)橹昂蜕ぢ?lián)系過，ta那邊有提過“ Y/R/K/M 之類的都屬于簡并堿基，以Y為例，此堿基表示C和T的簡并，我們合成的時候，這2個單體都是同時進(jìn)樣的，比例是1:1的，但是產(chǎn)物是隨機(jī)的。含有簡并堿基的這條鏈，嚴(yán)格來說，相當(dāng)于幾條鏈的混合物的�！� 那簡并度為8的引物配成10uM時溶液中個引物濃度 應(yīng)該是簡并度為1的引物配成10uM時溶液的 1/8 ？請問下我這個理解有沒有問題啊。 |
4樓2016-07-18 16:17:56
z631535213
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5樓2016-07-19 09:18:38
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