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小李紙11銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
構(gòu)建質(zhì)粒載體和目的片段一直連不上，總是載體自連。。。 已有6人參與
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| 如題，構(gòu)建質(zhì)粒載體和目的片段一直連不上，總是載體自連，結(jié)果一看選擇的兩個限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)幾乎相同，會產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，是這個原因么？酶切是完全的。。。該怎么辦才能把目的片段連上去呢？求助。。。 |
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小李紙11
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4樓2016-07-27 10:56:15
小李紙11
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5樓2016-07-27 11:10:23
6樓2016-07-27 13:01:21
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直接說摩爾數(shù)不就行了，我們一般采用1：3-1：10之間，因為估算不準(zhǔn)確，所以我們做一組高比例，在做一組低比例的，轉(zhuǎn)化前混合。這樣的好處是只要有一組比例合適，就有足夠量的連接產(chǎn)物。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
16樓2016-07-30 08:21:59
岳大白
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載體和片段摩爾比1:3到1:5試一試，其實(shí)這是一個概率問題，只不過你的成功鏈接的概率低而已，如果不能提高鏈接效率，那就增加驗證的菌落數(shù)量，挑單菌落的時候多挑一點(diǎn)（十個以上），如果嫌麻煩的話，把五個單菌落混到一起，這樣十組就有50個，把這十組做pcr驗證，如果有目的條帶的話就劃板,之后十分之一的概率能挑到陽性轉(zhuǎn)化子。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
21樓2016-07-30 22:00:33
2樓2016-07-27 10:01:50
3樓2016-07-27 10:16:39
匿名
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7樓2016-07-27 15:10:51
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8樓2016-07-28 06:40:09
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你做鏈接時vector和insert的比例用的多少，我們實(shí)驗室驗證過，比例對連接的效率影響非常大 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-07-28 17:45:06
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10樓2016-07-28 17:54:43
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