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zhangxf2014新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
定量PCR 已有3人參與
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| 剛開(kāi)始做定量PCR，用的SYBR染料法，陰性對(duì)照（只加水）總是有擴(kuò)增，Ct值都在35以下。之后換實(shí)驗(yàn)室、換水、換槍?zhuān)镏匦潞铣�，試劑也是新開(kāi)的，但是還是存在陰性擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，NTC條帶和目的基因的一致�，F(xiàn)在用UDG試劑做的，問(wèn)題仍然無(wú)法解決，實(shí)在想不通是什么原因？實(shí)驗(yàn)室有個(gè)老師半個(gè)月就把定量做完了，我這都做了2個(gè)月了。求大神賜教�。。�！ |
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skull123
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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污染可能存在以下幾個(gè)方面： 1、以前有人做過(guò)你所擴(kuò)增的片段的擴(kuò)增，導(dǎo)致整個(gè)環(huán)境中到處都是。 2、擴(kuò)增的時(shí)候自己沒(méi)有注意好，導(dǎo)致環(huán)境、試劑、槍頭等污染了目的擴(kuò)增片段。 即使用了UDG，因?yàn)槿绻皇亲铋_(kāi)始就用這個(gè)的話，是無(wú)法防止污染的。因?yàn)閁DG的原理導(dǎo)致它不能解決使用前所發(fā)生的污染，只能解決它自身體系的污染。 實(shí)驗(yàn)室污染解決的辦法：如果是整個(gè)大環(huán)境污染，每天晚上用5%的84消毒液霧化消毒，超凈臺(tái)、離心機(jī)轉(zhuǎn)子等關(guān)鍵儀器用10%84消毒液全部擦拭，第二天早晨再用清水擦洗環(huán)境，大約經(jīng)過(guò)一個(gè)星期后，應(yīng)該可以讓ct值降到37、38甚至沒(méi)有，提dna和提rna都別開(kāi)超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)（不開(kāi)風(fēng)機(jī)提取核酸完全沒(méi)問(wèn)題的，而且如果污染，超凈臺(tái)上面的那層濾網(wǎng)上面估計(jì)富集了很多目的片段）、槍頭用帶濾芯的槍頭，EP管直接用商家處理好的。等等。 解決污染是一個(gè)非常痛苦的過(guò)程，因?yàn)檎麄�(gè)環(huán)境中都是84消毒液的味道是很難聞的一件事。我的實(shí)驗(yàn)室每天都在堅(jiān)持，但是還是經(jīng)常陰性對(duì)照的ct值在35之后起來(lái)。 其實(shí)最好的方法是找一個(gè)沒(méi)有做過(guò)你的基因相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室，用全新的試劑來(lái)做這個(gè)實(shí)驗(yàn)，并且剛開(kāi)始就使用UDG防污染體系。 |
7樓2016-08-08 10:24:43
zhangxf2014
新蟲(chóng) (小有名氣)
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2樓2016-08-07 18:14:26
stone2239
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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3樓2016-08-07 18:58:29
zhangxf2014
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4樓2016-08-07 19:01:17
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